２培養室へ入る前の注意

雑菌やホコリを持ち込まない！

• 体がホコリっぽくはないか？ 少なくとも，ホコリのついた白衣は脱ぐ
• 昼休みにグラウンドでサッカーをやって，そのまま培養室へ直行する，などということでは皆に嫌われる
• 動物室で実験した後は，動物の毛や餌や排泄物が体についているかもしれない．そんなときは，下宿へ帰ってシャワーを浴びてからでないと培養室へ入らない学生がいた．そのくらいの気遣いはほしい
• 家でペットを飼っている場合も要注意．動物（人間もだが）には，マイコプラズマがあり，培養細胞がマイコプラズマに感染する危険がある．マイコプラズマ感染は，見た目ではわからない場合が多いが，実験の結果に大きな影響を及ぼす
• パン屋さんで朝アルバイトをしている大学生は，シャワーを浴びてから登校していた．酵母のコンタミは多いので気をつけたい．生ビールを飲んで無菌室へ入るのは別の意味でも問題だ

メモあるいは実験ノートくらいは持って，気付いたことは書きとめておこう

先輩は，一度注意したことは覚えているものと思う（期待する）だろう．「さっき注意したじゃないか」とか「昨日ちゃんと注意しただろう」と言われないように．優しい先輩でも同じ注意を3回もすると「コイツは覚える気がない」と思うかもしれない．

３まず前室へ入る

前室の必要性

無菌操作の準備をするための場所として，また，廊下の空気が直接に無菌室へ入らないようにするため，無菌室の手前に前室をおくことが望ましい．

前室への入室〜培養室入室の準備

１）前室へ入る

廊下側の扉と前室から無菌室に入る扉が同時に開いた状態にならないように注意してドアを開く．具体的には無菌室の扉が開いていないことを前室の扉のガラス越しに確認してから前室の扉を開く．

また履き終ったスリッパは整理して収納する．

２）白衣（実験衣）などを清潔なものに替える（研究室によってルールがあるだろう）

• 普段白衣を着ないで実験しているなら，培養室では専用の白衣を着る（体側から細胞側へ，細胞側から体側への雑菌の移動を防ぐ）
• 汚い白衣では，着替えても意味がない．定期的に洗濯したきれいな白衣を使う
• 長い髪はまとめておく
• 毛糸などを使ったセーターはぬぐ

３）手をよく洗う

培養室へ入って，何にも触らないということはありえないのだから，入る前には以下の手順で必ず手を洗う．

① 石けんで手をよく洗う（★1）

② 殺菌用の液に手をつける（腕の部分までしっかりと殺菌しよう）

③ 殺菌用の液につけてある手拭きを絞ってよく拭く（次ページの写真を参照）

④ 手袋をはめる

どんな機器があるか，先輩の説明を聞こう

１）冷凍庫，冷蔵庫

共通用冷凍庫の扉にはトリプシン/EDTA（細胞を継代するときに使うトリプシンとEDTAを含む溶液），血清の使用状況を記録するリストを貼っておくと扉を開けなくても，あと何本残っているかわかる．ビンを出す前にチェックすること．

ちょっと開けて中を見せてもらう

• 冷凍庫には，普段よく使うトリプシン/EDTAや増殖因子，その他の試薬が入っている
• 容器には，物の名前，所有者の名前，日付が必ず記入されている
• 冷蔵庫には，培地や試薬が入っている

重要なことは，共通で使用する物と個人で使用する物を置くスペースをきっちりと分けることである．冷蔵保存する培地に関しても，血清や抗生物質を含まない物のスペースと，血清や抗生物質を含む物のスペースを分けること．

培地を保存した共通用冷蔵庫では，自分用に培地を取り出すたびに本数を記録すること（あと何本残っているか，開けなくてもわかる）．

培地を自分たちで作製する場合は，必ず作製日などで培地のロットを管理すること．09-12-24-1〜 09-12-24-12（2009年の12月24日に作製した12本の培地に番号付けをした例）など番号をふって管理するとよい．

誰がどのロットの培地を使用したかわかるように冷蔵庫にこれらのロットを記入した培地使用リストを作成し，貼っておくとよい．

閉めたつもりが閉まっていないと，中の物がダメになる．増殖因子など高価な物や貴重な物がダメになるのはつらい．自動ドアや，手を離せば自然に閉まるドアが普及しているために，開けた後はキチンと閉めるという当り前の確認ができない人がいる．閉めたつもりではなく，「ドアを手で押さえて閉め，閉まったことを確認する」までを習慣づける．

２）水浴（ウォーターバス）

• トリプシン/EDTAや培地を温めるためや凍結した細胞を溶かすのにも使う
• 水浴に入れる水は水道水でよい．掃除はできれば毎日やる方がよい
• 小さいビン，中身の少なくなったビンが倒れないように，試験管立てを入れておく

水浴の水は，毎日交換する．水に防腐剤を入れておくとバクテリアの繁殖を防ぐことができる．防腐剤がないと1〜2日もすれば，水が濁ってくるが，防腐剤を入れておくと濁ったりはしない．防腐剤としては，クリアーバス（Spectrum Laboratories, Inc）などを使用する．CO₂インキュベータには用いないこと．

３）炭酸ガスボンベ

CO₂インキュベーターに供給するCO₂は，炭酸ガスボンベから供給する．

施設によって供給方法が異なるが，多くは写真のような炭酸ガスボンベを用いて行っているところが多い．

• ゲージの見方や取りつけ方は，後で先輩に聞こう（特別実習1-3を参照）
• バルブの開け方，閉め方も，取り替える際によく聞いておこう

労働安全衛生法によりガスボンベは，必ず下部と上部の２カ所をチェーンで止めなければいけない．

炭酸ガスがなくなると細胞は死んでしまう．通常，最低でも予備を1本は置いておく．交換したら，すぐに新しいものを発注しておくこと．

４無菌室へ入る

無菌室の特徴

通常の培養室では，無菌室と称しても，無菌操作をする部屋という程度であって，部屋として無菌状態を保てるわけではない．普通の実験室より浮遊する雑菌が少ないだけである ^ⓐ．

どんな機器があるか，先輩の説明を聞こう

１）CO₂インキュベーター

CO₂インキュベーターは細胞培養器で庫内の温度，湿度，および，培地のpHを一定に保つための機器である．

通常，温度37℃，湿度100％，CO₂濃度５％である．O₂濃度は通常20％だが，N₂で置換しO₂濃度をコントロールできるものもある．

温度表示

哺乳類細胞は通常37℃で培養する．温度感受性の変異株などは32℃，あるいは34℃や39℃，あるいは40℃で培養することもある．

たいてい，温度設定のための表示と，実際の庫内温度の表示が別々にあるが，同じ窓に表示される場合もある．

機械というものは必ず壊れるものである．表示された数字を頭から信じる，という態度はいけない．扉を開けたときの体感温度がいつもと違う，ということで表示の故障に気付いた学生がいた．エライと思う．

炭酸ガス濃度表示

最近の機種は，炭酸ガス濃度をモニターし，濃度が下がったときだけ炭酸ガスを注入するようになっている．センサーにはいくつかの方式があるので，先輩に聞くか，仕様書を後で読んでおくことにする．

培地のpHは重炭酸バッファーで緩衝されている．体内のpHも主に重炭酸イオンで緩衝されている．他の緩衝液に比べて細胞に対する毒性が小さい．通常の培地は，95％空気，5％炭酸ガスの気相のとき，培地のpHが7.4に保たれる．細胞によっては炭酸ガス濃度が3〜10％の間で変更される場合もある．空気中の炭酸ガス濃度はほとんど0％に近く，そのままでは培地から炭酸ガスが逃げて培地のpHはアルカリ性に傾く．

その他の表示

その他，庫内の湿度や酸素濃度が表示される機種も多い．

電源について

CO₂インキュベーターの電源は，天井からラインをもってくると管理しやすい．

• 扉を開けると，中にガラスの扉がある．これも開ける．扉が保温されていないタイプでは，ガラスの内側に水滴がつくことがある．カビを培養するもとになるので，アルコール綿をきつく絞って拭く
• 中に金属のトレイがあって，その上に培養ディッシュなどが並んでいる
• 一番下に，湿度を保つための水を入れたバットがある．水が足りなくならないように気をつけ，蒸留水あるいはMilli-Q水（ミリポア社の超純水製造装置で作った水）を補給する．水の中には防腐剤として，デヒドロ酢酸ナトリウム一水和物を1g/Lの濃度で溶かしておく
• 長くながめていると炭酸ガス濃度が低下し，温度と湿度が下がるので，早めに扉を閉めよう．扉の解放中は炭酸ガス濃度が下がっても炭酸ガスは注入されない
• CO₂インキュベーターは非常に重い．これはウォータージャケットといって，外壁の中に37℃の水が入っているからである．比熱の大きい水で満たすことによって庫内温度の変動を小さく抑えるためである．もちろん，ウォータージャケット用のヒーター，温度センサーがあり，必要に応じて設定を変えられる．この水も少しずつ蒸発するのでときどき補給すること

• ガラス扉のノブをきちんと閉めないと，機械は扉解放と認識し，炭酸ガスの導入をしない．きちんと閉めることでセンサーが働き，炭酸ガスをフラッシュ注入して5％にまで戻す．センサーは，外扉についているタイプとガラスドアのノブにある場合があるので，自分の研究室のセンサーを確認しておこう．ただし，センサーが付いておらず炭酸ガスを流し放しの機種もある
• ガラス扉をキチンと閉めずに帰り，炭酸ガスの補給がなかったために，翌日には培地が紫色（アルカリ性）になっていて，細胞が全滅したことがある
• 外の扉も閉める．振動を与えないように，静かに閉める

２）クリーンベンチ

クリーンベンチ内は無菌状態に保たれる

• 操作中は，上または奥の壁から手前に向かって無菌空気が吹き出し（ブローアウト型），無菌作業をする空間をつくる．無菌空気がエアーカーテンで手前から吸い込まれ，作業者側に風が吹き出さないバイオハザード対応のタイプもある
• いずれのタイプも空気は0.22 μmのフィルターを通して除菌されており，フィルターはときどき交換しなければならない（差圧計のメーターをチェックする）
• 足元の給気プレフィルターは１週間に１度掃除する方がよい

• 原則として，クリーンベンチ内には余計な物を入れておかない．物があると，影になったところは殺菌灯が効かない
  やむを得ずクリーンベンチ内に入れておく物，例えばチップなどのプラスチック製品はUVで劣化するので，入れるなら必ずアルミホイルなどUVを通さないカバーをかける（カバーの下は殺菌されない）
• 殺菌灯や蛍光灯が切れたら，すぐ取り換える．クリーンベンチの外に保管してある新品にはたいていホコリがついている．きつく絞ったアルコール綿でよく拭き，十分に乾いてから取り付ける

• 前面パネルには，殺菌灯，蛍光灯，ブロアーなどのスイッチ，風量計などが並んでいる

３）クリーンベンチのまわり（★1）

廃液トラップと吸引ポンプ（アスピレーター）

• 培地を吸い取るときに使う．吸引ポンプは，排気中に油が出ないものがよい．油のミストが培養室中に排出されると，油が培養器や器具について，細胞が生えなくなる原因になる．廃液のトラップは少なくとも（使う度でなくてもよいが）毎日空にして，洗浄しておく

ガスの元栓

• ガスの元栓は閉めておき，使用時に開く（使用していないときは，壁または床の元栓も閉める）

小机および小型ボックス

• クリーンベンチで使うものが置いてある
• 菌ピペットの缶：ちゃんとフタが閉まっている
• 引き出しには，ピンセット，駒込ピペットのキャップ，ビニールテープ，ハサミ，使いかけのディッシュなどが入っている．小物をむきだしで置いておくとホコリをかぶるので，必ず缶に入れるか引き出しにしまうこと．

動かしやすい小型ボックス（プラスチックラックなど）にディッシュ，ピペット，ピンセットなどの小物を入れると便利．床を掃除するときも，動かしやすいのでいつも清潔に保てる．上段の小さな引き出しは，ピンセット，ピペットマン，ビニールテープ，マジックなどよく使うものを入れる．中段は，ディッシュ，フラスコ，プレートなどを入れておく．開封済み（使用中）のディッシュなどは，開封口をしっかりテープやクリップで留めておくこと．大きなピペット管は，最下段の引き出しか，使用頻度が高ければ上部に置いておく．ただし，クリーンベンチに入れるときは，エタノールできれいに拭いてから入れること．

使用済みのピペットを入れるバケツ

• ピペットが十分に浸かるようなものを用いる

４）倒立位相差顕微鏡

• 細胞の観察に必須．倒立でかつ位相差のシステムが培養細胞観察の標準である
• 倒立型とは，上写真：右のように対物レンズが上向きになっている顕微鏡である．通常の顕微鏡は，下から光をあて，観察する物を通った光を，上側にある対物レンズで受けるが，倒立顕微鏡は上から光をあて，観察する物を通った光を，下側にある対物レンズで受ける．こうすることでレンズと細胞との距離を近づけている．フタのついたディッシュなどの厚みがあるようなサンプルの場合，下部にレンズを設置しないとピントが合わず観察することができない
• 培地の中に生えている細胞は透明で，普通の顕微鏡ではほとんど見えない．位相差顕微鏡は透明なものでも屈折率の違いがあるとコントラストがつくため，細胞がよく見える．先輩に細胞をちょっと見せてもらえるとよい



• 顕微鏡には，簡易型の観察専用の顕微鏡（ 前ページ写真：左 ）と，カメラやビデオなどを設置できるポートがある顕微鏡がある． 前ページ写真：中央 のように，上部にCCDカメラを設けてモニターに映すことができる．顕微鏡にCCDカメラをつけておくと，モニターで細胞の観察ができ，複数の人数で細胞の観察ができる．また，細胞の画像を電子記録することができ，観察記録として保存できる．

５）蛍光顕微鏡

いつ，どのような目的で使用するのか？

無菌室にどうして蛍光顕微鏡が置いてあるのか，不思議に思うかもしれない．今日では，さまざまなタンパク質の遺伝子に蛍光タンパク質 ^ⓑの遺伝子をつなげて細胞に導入し，実験が行われている．これによってタンパク質が細胞内で生産される様子や，生産されたタンパク質が環境変化に応じて細胞内で局在を変化させたり移動する様子を，生きた細胞のままで観察できるようになった．蛍光標識したタンパク質を生きたままの細胞で観察するために，無菌室に蛍光顕微鏡が置いてある．

構造と原理

蛍光顕微鏡には，標本の上部にある対物レンズを通じて紫外線を照射する落射型蛍光顕微鏡と，標本の下部にある対物レンズを通じて紫外線を照射する倒立型蛍光顕微鏡とがあるが，ディッシュ等に生えている生きた細胞を観察するには，倒立型蛍光顕微鏡を用いる．落射型では，標本の上部にある対物レンズを通して紫外線が照射され，発する蛍光像を対物レンズを通して観察するので，ディッシュのフタと培地とによって対物レンズが標本（細胞）に近づけないために焦点が合わないことに加えて，ディッシュのフタと培地とによって紫外線が遮られて，十分な紫外線が細胞に到達せず蛍光を発しないからである．倒立型でもディッシュの底から紫外線を照射するので紫外線の減弱は起きるが，落射型に比べれば減弱は少なくて済む．

蛍光顕微鏡の維持と操作には熟練が必要なので，ここでは操作を先輩に任せて，いくつかの例を見せてもらうだけにしよう（蛍光タンパク質を発現させた細胞の様子については巻頭カラー図４参照）．使いこなすためには別の本 ^ⓒを参考にしながら，先輩からの手ほどきを受けてもらいたい．

６）実験台の引き出し

• 培養室で使うさまざまな道具が入っている
• 使用頻度の高い道具をすぐに取り出せるように工夫して収納するとよい
• 引き出しの第一段目は，その机で使用する頻度が高いものを入れる
• 細胞をカウントする顕微鏡の置かれた台の引き出しには，ピペットマン，血球計算盤などを入れておく

７）戸棚

• 培地ビン，トリプシン/EDTA用のビン，ピペット缶などの滅菌した器具が収めてある．戸棚の扉はちゃんと閉まっている

８）水浴（27ページと同様）

• 無菌室で培地を保温しながら使いたいときに用いる

９）遠心機

• 細胞を遠心するのに使う．3,000回転くらいまでの低速遠心機でよい
• マイクロ遠心機は培養室での実験用の細胞の回収などに用いる

• 培地がこぼれたところにカビが生え，回転中に胞子をまき散らすようではおおごとである
• ローターもローター室（ローターが回転する場所）も清潔に保つこと

10）その他

幹細胞研究などを行う研究室では，セルソーターなどを無菌室あるいは隣の部屋に入れている場合もある．また，細胞へDNAを注入するエレクトロポレーション装置や顕微注射（マイクロインジェクション）装置などが置かれている場合もある．