達人に訊くバイオ画像取得と定量解析Q&A

はじめに【加藤　輝，小山宏史】

第Ⅰ部　顕微鏡観察

第1章　顕微鏡・画像の基礎

Q1　カラーカメラと白黒カメラの使い分けを教えてください．【村田　隆】

Q2　いろいろな種類のカメラがありますが，何が違っていてどのように使い分ける必要があるのでしょうか？【坂本　丞】

Q3　共焦点顕微鏡はどのようなカメラで撮っていますか？【亀井保博】

Q4　二光子顕微鏡は何が利点ですか？また，使い分けについて教えてください．【亀井保博】

Q5　顕微鏡画像のピクセルは細かいほどよいのでしょうか？【村田　隆】

Q6　8 bit画像と12 bit画像の違いは何でしょうか．画像取得ではどちらを使えばよいのでしょうか？【村田　隆】

Q7　LUTとは何のことでしょうか．【村田　隆】

Q8　共焦点顕微鏡で撮影したらGFPが緑色，RFPが赤色の画像が表示されました．表示色を変えてもよいのでしょうか？【村田　隆】

Q9　撮影した画像はtiff形式で保存するのがよいですか？【村田　隆】

Q10　レビュワーから三次元画像解析データを求められましたが，大学内にも三次元撮影できる顕微鏡はないです．どこかで借りられますか？【亀井保博，加藤　輝】

第2章　画像解析のための顕微鏡観察法

Q11　画像解析する前にあらかじめ確認しておくべき基本的かつ一般的な事柄は何かありますか？【亀井保博】

Q12　タンパク質の標識などに蛍光物質をよく使いますが，そもそも蛍光とは何ですか？【亀井保博】

Q13　蛍光物質には大きく分けると蛍光色素と蛍光タンパク質の2種類があると聞きましたが，両者の違いと使い分けを教えてほしいです．【亀井保博】

Q14　GFPを発現させた培養細胞の画像を撮影して輝度測定を行う予定です．どのような機材が必要でしょうか．【村田　隆】

Q15　遺伝子発現量（プロモーター活性）を蛍光画像から定量したいです．注意点は何ですか？【亀井保博】

Q16　弱い蛍光を経時的に定量したいですが，退色が速いです．どうしたらいいですか？【亀井保博】

Q17　免疫染色したサンプル間で1細胞あたりのタンパク質の発現量を比較したいのですが，注意する点は何ですか？【坂本　丞】

Q18　蛍光物質で細胞内の物理パラメータの変化（pHやカルシウムイオン濃度など）を測定している論文がありますが，どのような原理や方法で定量しているのでしょうか？【坂本　丞】

Q19　蛍光寿命イメージングとは何ですか？ 退色のことですか？【亀井保博】

Q20　さまざまな観察法のうち，培養細胞の計数を自動化するのに適した手法は何でしょうか？【坂本　丞，谷口篤史】

Q21　生体（胚）の細胞系譜解析（細胞トラッキング）を行いたいのですが，どのような撮影法がありますか？【村田　隆】

Q22　透明化試料を観察したいのですが，イメージングで気をつけることはありますか．【野中茂紀】

第3章　顕微鏡観察の工夫

Q23　自分の顕微鏡で輝度定量が正しくできるのか心配です．どのように確かめたらよいでしょうか．【村田　隆】

Q24　厚みのある試料で輝度定量する場合の注意点を教えてください．【村田　隆】

Q25　立体物の形状を評価したいのでZスタックから再構成画像を作ったのですが，画像が細長く伸びているようです．何が問題なのでしょうか．【村田　隆】

Q26　FRETセンサーを用いた計測を行いたいのですが，色素によって退色速度が異なるようです．どのように扱えばいいですか？【坂本　丞】

Q27　画像の中央とへりで背景の明るさが違うようです．どうすればよいでしょうか？【村田　隆】

Q28　マルチカラー（複数の蛍光タンパク質など）で共局在を調べたいのですが，毎回撮影した画像の辺縁部だけが共局在しません．なぜでしょうか？【亀井保博】

Q29　タイムラプス画像で位置のずれが生じてしまうのですが補正できないでしょうか．あるいは，ブレの補正のために試料側でできることはありますか．【谷口篤史】

Q30　植物サンプルの長時間タイムラプス撮影を行いたいのですが，撮影以外の時間は光を当てておく必要があります．どうしたらいいですか？【坂本　丞】

第Ⅱ部　画像解析

第1章　画像解析・ImageJの基礎と概念

Q31　たくさんの画像をもっているのですが，何か計測できませんか？ 例えば，野生型と変異体から取得した画像があるのですが，何かの差を定量的に評価できませんか？【小山宏史】

Q32　ImageJのメニューにある画像処理法をそのまま使えば，一貫性（再現性，客観性）のある画像解析を実現できますか？【小山宏史】

Q33　手作業で定量すると客観性が失われそうですが，コンピュータの画像処理法を用いれば，客観的な定量が実現できますか？【小山宏史】

Q34　自分で作成した画像処理法によって正しい結果が得られているかはどのように判定すればいいですか？【小山宏史】

Q35　画像処理によって，人の目では見えなかったものを見えるようにすることはできますか？【小山宏史】

Q36　コンピュータに構造物を認識させるとはどういうことですか？【小山宏史】

Q37　画像処理といえば，通常コンピュータに処理させることを指すと思いますが，人ではできないことは何ですか？【小山宏史】

Q38　結局，画像処理は何を行っているのですか？【小山宏史】

Q39　画像処理ってデータの改竄と同じではないですか？【小山宏史】

Q40　画像処理に求めてはいけないことはどんなことがありますか？【小山宏史】

Q41　画像処理において誤用の危険性がある代表的な処理を教えてください．【小山宏史】

Q42　画像処理について勉強したいのですが，画像工学の書籍を見ると生物研究には使わなさそうな内容が多いように感じてしまい，学習意欲がわきません．何かよい勉強法はないでしょうか．【小山宏史】

Q43　輝度を定量するときに気を付けるべき点はどのようなことですか？【村田　隆】

Q44　共焦点顕微鏡で得られた連続断層画像を使って輝度を比較するには，どのような評価法を用いるべきですか？【村田　隆】

Q45　撮影した画像に暗い部分と明るい部分があり，両方を示そうとするとどちらかが暗くなったり明るくなったりして見にくいです．どうしたらよいでしょうか．【村田　隆】

Q46　ImageJの機能によっては16 bitに対応していないものがあるようです．8 bitに変換したいのですが何か注意点はありますか？【小山宏史】

Q47　顕微鏡画像がImageJや市販のソフトウェアで開けません．なぜでしょうか？【村田　隆】

Q48　ImageJとFijiはどう違いますか？【村田　隆】

Q49　ImageJのマクロとプラグインはどのような違いがあるのでしょうか？【坂本　丞】

第2章　ImageJによる定量解析

Q50　画像処理で2値化を行い，対象物を抽出したいのですがうまくいきません．よいアイデアはありますか．【村田　隆】

Q51　2値化するときに，Auto thresholdの項目を見るとたくさんの方法が列挙されています．どれを選んだらいいですか？【小山宏史】

Q52　カラー画像を2値化して対象を抽出したいのですが，グレースケール画像に変換してから2値化するとうまくいきません．どうにかなりませんか．【野中茂紀】

Q53　閾値法（Threshold）で処理したり，2値化画像に対してBinaryフィルタ処理をすると，白と黒の挙動が期待と逆になることがあります．どうすれば直りますか．【谷口篤史】

Q54　スタック画像について各スライスを一括で2値化したいのですが，閾値（threshold）がスライスごとに勝手に変わってしまいます．どうすれば同じ値で処理できますか？【谷口篤史】

Q55　背景を除去するための処理法としてどういった方法がありますか？ ImageJではRolling ball法という処理があると聞きましたが有効ですか？【小山宏史】

Q56　背景が複雑な画像から目的の構造物だけを抽出したいのですが，閾値を設定してもうまくいきません．いい方法はありますか？【小山宏史】

Q57　繊毛や血流など動く成分だけをとり出せないでしょうか．【野中茂紀】

Q58　バックグラウンドが高め（全体的に自家蛍光がありそう）なサンプルなのですが，バックグラウンドを全体から引けば輝度定量をしてもよいですか？【坂本　丞】

Q59　細胞内小器官の輝度を定量したいのですが，細胞質も光っています．画像処理で細胞質の明るさを引き算してよいでしょうか．【村田　隆】

Q60　構造物の形態を計測したいのですが，2値化したときに構造物の輪郭が凸凹になってしまい輪郭を正確に抽出できません．どうすればいいですか？【坂本　丞】

Q61　粒子解析（Particle analyzer）では計数すべき粒子の面積（Size）と円形度（Circularity）の範囲を指定できますが，他の指標も使えないでしょうか？【野中茂紀】

Q62　細胞などの輪郭を抽出したいのですが可能ですか？【小山宏史】

Q63　細胞などの輪郭や繊維状の構造物について，特定の方向のもののみ抽出したいのですが可能ですか？【小山宏史】

Q64　ピクセルで構成されたデジタル画像では，曲線の長さをどのように計測すればいいですか？【小山宏史】

Q65　繊維状の構造物の交点や端点を自動で認識して，計数することはできませんか？【加藤　輝】

Q66　自由曲線上の輝度について計測することはできませんか？【加藤　輝】

Q67　歪んだ構造物の最大径を測りたいです．【加藤　輝】

Q68　波状の模様など周期的なパターンをもった画像の解析によい方法はありませんか？【小山宏史】

Q69　フーリエ変換を用いたフィルタは，周期的・波的なパターンがない画像に適用しても意味はありますか？【小山宏史】

Q70　2種類の分子が共局在しているか評価したいのですが，どのような方法がありますか？【坂本　丞】

Q71　観察対象を追跡する場合，PIVとトラッキングのどちらを使うのがいいでしょうか．【谷口篤史】

Q72　ノイズの除去のために，平均化フィルタ，中央値フィルタ，ガウシアンフィルタなどがあるようですが，使い分ける必要はありますか．【小山宏史】

Q73　解像度変更や画像回転をくり返しても，画質に影響はないですか？【村田　隆】

Q74　対象の組織や細胞が経時的に移動してしまい，さまざまな解析（輝度の定量など）がやりにくいです．位置合わせをすることはできませんか？【小山宏史】

Q75　テスト画像はなぜ重要なのですか？ 作成するにはどうすればいいですか？【加藤　輝】

Q76　画像処理の手順やパラメータをチューニングしても，100％の精度をどうしても達成できません．どうすればいいですか？【小山宏史】

Q77　さまざまなソフトウェアに実装されている画像処理法を用いて結果を得たのですが，中身がブラックボックスで不安です．【小山宏史】

Q78　さまざまな画像処理を施していると，自分が何を行ったのかわからなくなることがあります．記録する手段はないでしょうか．【野中茂紀】

第3章　ImageJマクロによる自動化・カスタマイズ

Q79　画像処理の自動化にはどのようなメリットがありますか．【野中茂紀】

Q80　ImageJのレコーダーとは何ですか．【野中茂紀】

Q81　レコーダーを使って自作のマクロを作成したいのですがうまく動きません．どのように修正すればいいでしょうか．【谷口篤史】

Q82　マクロレコーダーで記録しましたが，他の画像の処理にも使えますか？【加藤　輝】

Q83　元画像のファイル名を活用しつつ新たなファイル名を生成するなど，マクロで文字列を操作する簡単な方法はありますか？【加藤　輝】

Q84　多数のROIに対して順番に処理を施したいのですが，マクロで効率的に処理できませんか？【加藤　輝】

Q85　多数の画像に同じ処理を施したいのですが，パラメータの値だけは画像ごとに異なる数値を設定したいです．いい方法はありますか？【加藤　輝】

Q86　マクロでユーザ定義関数を自作したのですが，戻り値として複数の変数を指定することはできませんか？【加藤　輝】

Q87　画像処理で実際にどういった数学的な処理がされているかを自分でマクロを書きながら理解したいのですが，何か手ごろな課題はありませんか？【加藤　輝】

Q88　顕微鏡独自のファイルフォーマットを一括で変換したいです．【加藤　輝】

Q89　テキストファイルを含む任意の種類のファイルをマクロから読み書きする方法について教えてください．【加藤　輝】

Q90　マクロにダイアログ（対話型GUI）を導入したいのですができますか？【加藤　輝】

Q91　多数の画像に対して自動で同じ処理を施すために，マクロを使う以外の方法はありませんか？ プログラミングに抵抗があるので…．【小山宏史】

Q92　ImageJのマクロとは何ですか？ マクロを扱うための基本事項を教えてください．【加藤　輝】

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