基礎から学ぶ遺伝子工学　第３版

第3版の序

第2版の序

初版の序

概説　遺伝子工学 ―誕生から今日まで，そして未来へ

1．遺伝子工学とは

2．最初の遺伝子工学実験とその意味

3．遺伝子工学を発展させたエポック

4．遺伝子工学はどのように活かされているか

5．遺伝子工学の未来

第Ⅰ部　遺伝子・DNAの基礎

1章　遺伝子工学で使われる生物

1．遺伝子工学で生物を用いる目的

2．原核生物と真核生物

❶原核生物　❷真核生物

3．ゲノムと遺伝子

❶遺伝子　❷ゲノムと含まれる遺伝子

4．大腸菌

❶特徴　❷遺伝子型　❸培養　❹滅菌

5．遺伝子工学に登場する真核生物

❶酵母　❷多細胞動物個体　❸植物　❹培養動物細胞

6．遺伝子工学に利用される動物ウイルス

❶ウイルスとは　❷使用される主なウイルス

章末問題

2章　DNA：化学構造，複製，構造変化

1．DNAの構造

❶DNAはヌクレオチドが連結した分子　❷細胞のDNAは二本鎖として存在する

2．DNAの構造変化

❶一本鎖と二本鎖の間の変換　❷切断，剪断

3．DNAの複製

❶DNA合成反応の原則　❷細胞内で起こるDNA複製 　❸DNAポリメラーゼ　❹試験管内DNA合成

4．DNAのメチル化

❶メチル化部位　❷原核生物でのメチル化

5．DNAの変異，損傷，修復，および組換え

❶DNAの変異　❷DNAの損傷　❸損傷DNAの修復　❹DNAの組換え

章末問題

3章　遺伝子の発現

1．RNA

❶RNAとは　❷RNA機能の多様性　❸遺伝子発現制御能をもつncRNA　❹RNAのそれ以外の機能

2．転写機構

❶RNA合成：RNAポリメラーゼ　❷転写開始　❸転写終結まで

3．原核生物の転写制御

❶ポリシストロニック転写とオペロン　❷ラクトースオペロンの構造と制御機構　❸lacオペロンのグルコース効果

4．真核生物の転写制御

❶エンハンサーと転写制御因子　❷制御のメカニズム

5．転写後のできごと：RNAの加工と成熟

❶mRNAの末端修飾　❷スプライシング　❸その他の加工

6．アミノ酸，ペプチド，タンパク質

❶アミノ酸　❷ペプチド結合　❸タンパク質

7．翻訳

❶コドンとtRNA　❷翻訳機構

8．真核細胞で翻訳されたポリペプチドの運命

❶翻訳後のタンパク質　❷タンパク質の分解

章末問題

第Ⅱ部　基本の酵素からクローニングまで

4章　制限酵素，DNAメチラーゼ，DNAリガーゼ

1．細菌がもつ自己防衛手段：制限と修飾

❶現象の発見　❷制限修飾の実体

2．制限酵素発見の意義

3．制限酵素の種類

❶Ⅰ〜Ⅲ型酵素　❷制限酵素の分布

4．Ⅱ型制限酵素の反応特性

❶認識配列と切断部位　❷反応様式と切断面　❸制限酵素のスター活性

5．DNAメチラーゼと制限酵素の切断特性

❶制限修飾系でのメチル化　❷大腸菌で増やしたDNAのメチル化に関する注意

6．ホーミングエンドヌクレアーゼ

7．粘着末端を利用したDNAの連結

❶DNAの付着と連結　❷DNAリガーゼ反応の実際　❸同一粘着末端をもたないDNA末端の連結方法

章末問題

5章　核酸の合成，分解，修飾に関する酵素

1．DNA合成酵素

❶通常のDNA合成用DNAポリメラーゼ　❷クレノー断片　❸特殊な用途で使われるDNA合成酵素

2．核酸分解酵素

❶核酸分解酵素の区分　❷DNAに働くエンドヌクレアーゼ　❸DNAに働くエキソヌクレアーゼ　❹一本鎖特異的ヌクレアーゼ　❺RNAを分解する酵素：リボヌクレアーゼ（RNアーゼ）

3．DNAの平滑末端化

4．末端リン酸基の脱着

❶リン酸基の脱着　❷リン酸基脱着反応を遺伝子操作の中で応用する

5．組換えDNAからのin vitro RNA合成

章末問題

6章　プラスミド，ファージ，トランスポゾン

A．プラスミド

1．プラスミドの概要

❶プラスミドの複製とコピー数　❷不和合性

2．大腸菌のプラスミド

❶ColE1　❷R因子　❸F因子

3．その他のプラスミド

❶Tiプラスミド　❷他の細菌プラスミド　❸出芽酵母のプラスミド

B．大腸菌のファージ

4．ファージの種類と増殖

❶ファージとは　❷ファージの一般的性質　❸ファージの検出と定量：プラークアッセイ

5．λファージ

❶増殖：溶菌サイクル　❷溶原化サイクル

6．一本鎖ファージ：M13

❶概要と増殖　❷利便性

C．トランスポゾン

7．概要

8．DNAトランスポゾン

9．レトロトランスポゾン

章末問題

7章　ベクター ―DNAの導入，増幅，発現，組込みのツール

A．ベクターの基本

1．ベクターとクローニング

❶ベクターとは　❷ベクターの使用目的と材料別ベクターの種類　❸ベクターとしての要件　❹クローンとクローニング

2．選択マーカー

❶マーカーの意義と原理　❷検出方法によるマーカーの分類

3．ベクターの能力にかかわる機能性配列

❶マルチクローニング部位　❷制御配列

B．原核生物のベクター

4．主な選択マーカー

❶抗生物質に対する耐性遺伝子：薬剤耐性遺伝子　❷lacZ遺伝子と青白選択　❸致死ベクター

5．大腸菌のプラスミドベクター

❶古典的・標準的なプラスミドベクターと使われる菌株　❷多用途汎用ベクター　❸特定の目的で使用されるベクター

6．遺伝子発現用の大腸菌プラスミドベクター

❶遺伝子発現の基本戦略　❷大腸菌内での発現の方策

7．大腸菌用ファージベクター

❶λファージ由来の一般的クローニングベクター　❷λファージ由来発現ベクター　❸M13ファージベクター　❹混成ベクター

C．真核生物のベクターとマーカー

8．真核細胞中での発現制御系

❶真核細胞で使われるプロモーター　❷転写後シグナルと翻訳シグナル

9．真核細胞で利用されるマーカー

❶薬剤耐性遺伝子　❷代謝欠陥を補う遺伝子　❸致死遺伝子　❹レポーター遺伝子

10．酵母・真菌のベクター

❶ベクターのタイプ　❷マーカー遺伝子　❸カウンター選択

11．動物細胞用ウイルスベクター

❶レトロウイルスベクター　❷レンチウイルスベクター　❸アデノウイルスベクター　❹その他の動物ウイルス

D．トランスポゾンベクター

12．トランスポゾンベクター

❶概要　❷DNA型トランスポゾンベクターの使い方と特徴　❸動物細胞で使われるベクター

章末問題

8章　DNAクローニング ―新規クローンの単離とサブクローニング

A．古典的なゲノムDNAのクローニング法

1．古典的DNAクローニングの概要

2．ゲノミッククローニングの実際

❶ベクターの選択　❷ライブラリー用DNAの調製　❸目的クローンの選択　❹PCRによる選択

B．古典的cDNAクローニング法

3．cDNAライブラリーの作製

❶ライブラリー作製の要点　❷特異的cDNAの濃縮

4．cDNAに特異的なクローン選択法

❶結合性に基づく発現クローニング　❷機能性クローニング

C．ポストゲノム時代の遺伝子クローニング

5．現在のクローニング戦略

❶クローニング戦略の変化　❷ゲノムDNAのクローニング　❸cDNAクローニング

D．組換えDNAの再構築：サブクローニング

6．標準的なサブクローニング戦略

❶サブクローニングとその手順　❷DNAリガーゼによるベクターとDNA断片の連結

7．新しいPCR産物クローニング法

❶末端の特別な構造を介する組換え体の構築　❷シームレスクローニング

E．重要なDNA構築技術

8．オリゴヌクレオチド

9．部位特異的変異の導入

❶概要　❷Dpn Ⅰを使って変異DNAを作製・濃縮する方法

10．cDNAの合成

❶真核生物mRNAの調製　❷cDNAの合成

F．細胞へのDNA導入

11．原核生物（大腸菌）へのDNA導入

❶プラスミドによる形質転換　❷ファージ感染　❸目的クローンの選別と決定

12．動物細胞への核酸導入

❶トランスフェクション　❷ウイルスベクターを用いる方法

13．植物細胞への導入：Tiプラスミドを使う方法

章末問題

9章　タンパク質産生制御系

1．真核生物タンパク質の発現・産生

❶原核細胞での発現　❷真核細胞での発現

2．大腸菌でタンパク質をつくる場合の注意点

❶塩基配列とコドンバイアス　❷不溶タンパク質の可溶化と不溶化防止策　❸発現させるタイミングを工夫する

3．融合タンパク質の作製

❶β-ガラクトシダーゼ（β-gal）融合タンパク質　❷タグ付きタンパク質とその精製　❸ファージディスプレイ

4．T7 RNAポリメラーゼ発現系

❶pETベクター　❷発現制御系：pETシステム

5．真核生物でのタンパク質発現

❶真核細胞発現ベクターに求められる要素　❷バキュロウイルス発現系　❸テトラサイクリンによる発現制御系（Tetシステム）

6．遺伝子工学で使われるタンパク質分解酵素

章末問題

第Ⅲ部　核酸の取り扱いと構造機能解析

10章　核酸の取り扱いと検出

A．取り扱い

1．核酸の物理化学的性質

❶核酸一般の性質　❷DNA特有の性質　❸RNA特有の性質

2．DNAの調製

❶細胞からのゲノムDNAの抽出　❷細菌からのプラスミド抽出　❸細胞から抽出したDNAの精製

3．RNAの扱い：常に「分解阻止」を念頭に置く

4．核酸の濃縮

❶核酸のエタノール沈殿　❷その他の濃縮法

B．核酸同士の分離

5．ゲル電気泳動による核酸の分離

❶ゲルの素材と形状　❷通常ゲル（中性ゲル）による電気泳動　❸変性ゲルによる電気泳動　❹特別な目的のために行う電気泳動　❺ゲルからのDNA抽出

6．超遠心分離による核酸の分離

C．核酸の視覚的検出と定量

7．蛍光を用いて核酸を視覚化する

❶概要　❷核酸検出法

8．核酸の紫外部吸収

❶核酸の定量　❷核酸の純度

D．ハイブリダイゼーションによる核酸配列の探査

9．ハイブリダイゼーション探査の概要

10．核酸ハイブリダイゼーションの基礎

❶T_mに影響を与える要因　❷ハイブリダイゼーション実施条件

11．プローブの作製：DNAの標識

❶DNAのRI標識法　❷非RI標識DNAの調製

12．標識プローブの検出

❶RIプローブの検出：オートラジオグラフィー　❷非RIプローブの検出

13．ハイブリダイゼーション検出の実際

❶サザンブロッティング（RIプローブを使う例）　❷ノーザンブロッティング　❸基盤付着DNAの検出　❹in situハイブリダイゼーション

章末問題

11章　PCRによるDNAの増幅

1．PCRの原理と概要

2．材料と反応条件

❶プライマーの設計　❷耐熱性酵素の選択　❸反応液とサイクルプログラム　❹ホットスタートPCR　❺修飾温度サイクリング

3．遺伝子工学におけるPCRの利用

❶PCRの基本的な使われ方　❷微量DNA中の特定配列検出への応用　❸DNAシークエンシングへの応用　❹RNAの検出　❺新たな構造をもつDNAの作製　❻クロマチン結合タンパク質の検出

4．PCR産物の直接クローニング/サブクローニング

5．リアルタイムPCR

❶リアルタイムPCRとは　❷蛍光検出系　❸DNAが定量できる原理

6．デジタルPCR

❶原理　❷概要と応用

7．PCRによらないDNA増幅法

❶概要　❷非PCR DNA増幅の要点　❸ICAN法　❹LAMP法　❺RCA法　❻SATIC法　❼SmartAmp法

章末問題

12章　DNAシークエンシングとゲノム解析

1．ジデオキシ法によるマニュアルシークエンシング

❶原理　❷一本鎖鋳型DNAの準備　❸反応，電気泳動，検出　❹現在までに改良された点（昔のものから順に）

2．DNAシークエンサー（第一世代シークエンサー）

3．標準的次世代シークエンサー：NGS

【A】第二世代シークエンサー　❶PCR増幅と均一DNA集団の形成　❷反応系

【B】第三世代シークエンサー

【C】NGSを活用する　❶NGSを使用するまでの操作フロー：ライブラリー作製　❷NGSの応用

4．第四世代NGS：ナノポアシークエンサー

❶どういうものか　❷検出の概要と使い方　❸利便性，応用性，発展性

5．ゲノム解析

❶NGS以前　❷NGS以後

章末問題

13章　遺伝子発現と遺伝子産物の解析

1．内在性遺伝子の発現状態の解析

❶RNAやタンパク質の構造決定や同定の戦略　❷特定のRNAの検出・解析・同定　❸RNAの網羅的解析　❹タンパク質の検出・同定

2．シングルセル解析

❶概要　❷解析のプラットフォームとscRNA-Seqの実施

3．細胞を使った遺伝子の発現機能解析

❶導入遺伝子の一過的発現と安定発現　❷レポーターアッセイとその応用：転写系を利用した解析

4．in vitroでの遺伝子発現解析と遺伝子産物合成

❶in vitro転写　❷細胞抽出液による伝統的in vitro翻訳　❸PUREシステム：再構成遺伝子発現系

5．タンパク質-核酸相互作用の解析

❶in vitro反応による方法　❷細胞内での相互作用の検出

6．タンパク質同士の結合の解析

❶免疫沈降-ウエスタンブロッティング法　❷結合能をもつタグ付きタンパク質を使う方法

❸細胞を使う方法　❹ファーウエスタン法　❺結合タンパク質を網羅的に検索するその他の方法

7．イメージング解析

❶光学顕微鏡とその発展形　❷電子顕微鏡　❸走査型プローブ顕微鏡

章末問題

14章　エピゲノムとその解析

A．クロマチンとエピゲノム

1．クロマチンの基本構造

❶クロマチンとは　❷ヌクレオソームとヒストン　❸ヌクレオソーム形成反応　❹高次クロマチン構造：クロマチンの階層的折り畳み

2．エピゲノム：修飾されたクロマチン

❶DNAのメチル化　❷ヒストンの化学修飾　❸ヌクレオソームアレイの変更　❹クロマチン会合分子

3．エピジェネティクス

❶ゲノムインプリンティング　❷X染色体不活化　❸遺伝子の位置効果による斑入り

B．クロマチン，エピゲノムの解析

4．解析方針

5．メチル化DNAの検出

❶メチル化DNAの分離・調製　❷メチル化DNA配列の同定

6．クロマチンタンパク質の解析

❶解析の概要　❷個別部位における結合タンパク質の解析：ChIPアッセイ　❸結合部位の網羅的同定

7．高次クロマチン構造の解析

❶古典的なクロマチン分析法　❷オープンクロマチン領域の解析　❸3C法およびその関連法

章末問題

第Ⅳ部　遺伝子工学の応用と安全性の確保

15章　ゲノム工学と関連技術

1．ゲノム工学とは

A．遺伝子導入個体の作出とそれに付随する技術

2．遺伝子導入（トランスジェニック）個体の作製

❶作製法　❷トランスジェニック実験の評価

3．植物の生命工学

❶植物を対象とする生命工学　❷植物細胞への遺伝子導入　❸植物に特有な問題

B．ゲノムを狙った通りに改変する技術

4．遺伝子ターゲティング

❶概要　❷条件（コンディショナル）ノックアウト

5．ゲノム編集

❶背景と概要　❷初期に開発された方法　❸現在の主流：CRISPR/Cas9法 ❹CRISPR/Cas9法の課題

6．新しい時代のCRISPR/Cas9利用法

❶基盤技術の進歩　❷Cas9をニッカーゼとして使う　❸トランスポゾンとの相互作用を利用する　❹エフェクターの多様な機能を利用する　❺因子集積プラットフォームとして使う

章末問題

16章　小型核酸による細胞機能の特異的制御

A．総論

1．特異的細胞制御因子としての小型核酸

❶概要　❷使い方

2．使用に関する基本的留意点

❶分解抵抗性付与　❷細胞移入法　❸オフターゲット効果

B．各論

3．アンチセンス核酸

❶概要　❷作用機構　❸分子デザイン　❹ヘテロ二本鎖としての使用

4．siRNAとRNA干渉

❶RNA干渉：始まりと概要　❷遺伝子ノックダウン　❸遺伝子抑制機構　❹siRNAのデザイン　❺shRNAによる恒常的遺伝子抑制

5．マイクロRNA

❶マイクロRNA（miRNA）とは　❷miRNAにかかわる核酸医薬

6．アプタマー：結合性核酸

❶アプタマーの発見　❷改良や応用

7．リボザイム

8．デコイとしての使用

9．自然免疫賦活化活性をもつCpGオリゴ

章末問題

17章　医療における遺伝子工学

A．医薬

1．新規創薬モダリティの移り変わり

2．抗体医薬

❶免疫療法　❷単クローン抗体とその作製　❸単クローン抗体のヒトへの適用　❹抗体の医薬としての使い方　❺抗体医薬の進化

3．核酸を医薬として使う

❶核酸医薬というモダリティ　❷薬剤の組織デリバリー（送達）　❸毒性

4．核酸ワクチン

❶ワクチンとは　❷核酸ワクチンの多様性

B．治療

5．遺伝子治療

❶遺伝子治療という選択肢　❷遺伝子治療の経緯　❸遺伝子導入のためのベクター　❹遺伝子改変T細胞療法　❺その他の取り組み

C．細胞の脱分化・分化・移植

6．幹細胞工学，組織工学，再生医療

❶分化，幹細胞，再生　❷人工的な多能性幹細胞　❸多能性幹細胞を使う再生医療　❹分化細胞の移植に関する課題　❺iPS細胞を用いるその他の取り組み

D．新しい時代の生命科学

7．膨大なデータに基づく生命科学

❶シングルオミクスからトランスオミクスへ　❷生命情報に基づく医学・医療　❸最新生命科学研究の潮流

章末問題

18章　遺伝子操作における安全性確保：カルタヘナ法

1．遺伝子組換え実験の自己規制

2．カルタヘナ法の成立

❶その後の経過　❷カルタヘナ議定書　❸法令で使用される用語の意味　❹法令に規制されない遺伝子組換え実験

3．遺伝子組換え生物の使用と実験分類

❶遺伝子組換え生物等（LMO）の使用形態と実験の申請　❷機関承認実験と大臣確認実験　❸実験分類

4．実験の種類と拡散防止措置

❶実験の種類　❷拡散防止措置

5．留意すべきこと

章末問題

付録

索引