はじめに

microRNA（miRNA）は1993年に初めて発見された1）．線虫の幼生期において，発生のタイミングを調節するタンパク質であるLIN-14の発現を調節する因子として見出されたのがlin-4という22塩基長のタンパク質をコードしない小さなRNAであった1）．lin-4は，LIN-14のmRNAの3′非翻訳領域（3′untranslated region, 3′-UTR）に数カ所存在する，部分的に相補的な塩基配列にアンチセンス鎖として対合して，その翻訳を抑制することが明らかにされた．このようなRNA同士の遺伝子発現制御機構は新規の特殊な現象として捉えられた．そのため，線虫でやはり発生を制御する2つ目の小さなRNAとして21塩基長のlet-7が同定されたのは，lin-4が発見されてから7年後の2000年になってからであった2）．let-7は無脊椎動物に限らず，脊椎動物にも広く保存されていることが明らかになり，それまで認識されていたよりも，このような小さなRNAが一般的に広く存在する遺伝子調節因子であることが示された．2001年には，線虫だけでなくヒトでも次々とこのような小さなRNAが存在することが明らかになり，“microRNA”とよばれるようになった．

miRNAは核内のゲノムから転写された後，2段階のプロセシング過程を経て成熟型となり，標的遺伝子を抑制する（図1）．そして，細胞質において，部分的に相補的な塩基配列をもつmRNAに対合して，その翻訳過程を抑制する．このような現象は，RNAサイレンシングとよばれる．ヒトではすでに2,000種以上のmiRNAが見出されている一方で，大腸菌や酵母ではほとんど存在しないこともわかっている．また，多くの場合，miRNAは多数の遺伝子を一括して抑制するだけでなく，その程度もさまざまという非常に複雑な遺伝子発現調節機構をもつ．このような巧みな微調整可能な調節機構は，ヒトに特異的な高次な生体防御機構や，ひいては学習・記憶・思考などの高次脳機能の調節などに適したシステムといえるかもしれない．本稿では，まずmiRNAの生合成のメカニズムについて触れ，生合成された成熟型miRNAによる標的遺伝子の識別機構とそれを制御するメカニズム，塩基対合の熱力学的安定性による標的遺伝子の抑制効率の制御について解説する．さらには，二本鎖RNA結合タンパク質同士の相互作用によるmiRNAの生合成の調節機構についても，ヒトにおける生体防御機構におけるmiRNAの役割などに触れながら概説し，最後にmiRNAの分解機構について最近の知見を紹介する．

miRNAの生合成と標的認識・抑制

miRNAはゲノムDNAから転写された後，2段階のプロセシングを経て成熟型miRNAとなり，RNA-induced silencing complex（RISC）を形成して標的遺伝子を抑制する（図1）．まず最初にmiRNAは，RNAポリメラーゼⅡによって一本鎖のprimary miRNA（pri-miRNA）とよばれるヘアピン構造をもつ数百〜数千塩基の長いRNAとしてゲノムDNAから転写される．miRNAは，遺伝子間領域から独立した転写産物として転写される場合もあるが，遺伝子内のイントロン領域から転写される場合もある3）．いずれの場合も，例外的なものを除いて，転写されたpri-miRNAは，RNaseⅢファミリーに属するRNAの切断酵素Droshaと補因子であるDGCR8から構成されるマイクロプロセッサー複合体に取り込まれる．pri-miRNAの末端ループ領域にDGCR8が，stem-flank junction領域にDroshaが結合することで，pri-miRNAの二次構造全体が認識された後，DroshaのRNaseⅢ活性によって55〜70塩基程度のヘアピン型のprecursor miRNA（pre-miRNA）へとプロセシングされる（図1）．

このように1段階目のプロセシングを受けたpre-miRNAは細胞質輸送タンパク質であるExportin 5とRan-GTPの複合体に取り込まれ，核から細胞質へと輸送される．細胞質においてpre-miRNAは，やはりRNaseⅢファミリーに属するRNA切断酵素Dicerにより2段階目のプロセシングを受ける．DicerのPAZドメインがpre-miRNAの2塩基のオーバーハングを認識して結合し，RNaseⅢ活性により反対側の末端ループ付近を切断するが，PAZドメインとRNaseⅢドメイン間の距離がmiRNAのサイズを決める定規の役割を担っており，21〜25塩基程度のmiRNA duplexとして切り出される4）5）．

DicerによってプロセシングされたmiRNA duplexは，Argonaute（AGO）タンパク質に取り込まれ，RISCローディング複合体（RISC-loading complex：RLC）が形成される．AGOタンパク質に取り込まれたmiRNA duplexのうちパッセンジャー鎖は，一本鎖化して取り除かれ，残ったガイド鎖が成熟型miRNAとして働く（図1）．ガイド鎖の5′末端から2〜8番目の7塩基はシード領域とよばれる．シード領域はAGOタンパク質上の溝状の構造にしっかり固定されるため，AGOの表面上でmiRNAと相補的な配列を3′UTRにもつmRNAは安定に対合し，塩基配列の違いを利用してさまざまな遺伝子の発現調節を行う（図1）．シード領域はたったの7塩基であるため，確率的にも1種のmiRNAが1種のmRNAのみを標的として抑制する可能性はきわめて低く，通常は1種のmiRNAが多数のmRNAを一括して抑制する．さらに，シード領域以外にガイド鎖の5′末端から13〜16番目の領域も補助的に標的mRNAと対合する場合があり6），この場合には構造変化をおこすことで標的抑制活性をわずかながら促進することが報告されている7）．miRNAによる標的抑制能は，AGO2タンパク質の翻訳後修飾によっても制御される．CRISPR-Cas9による機能欠失スクリーニングとmiRNAのレポーターアッセイを組合わせた網羅的解析により，AGO2タンパク質のリン酸化/脱リン酸化サイクルを担う因子が発見された8）．これらの因子によるAGO2のリン酸化は，標的mRNAとの結合の強さや正確性に関与している．標的mRNAと結合したAGOは足場タンパク質であるtrinucleotide repeat containing 6（TNRC6）をリクルートすることで，TNRC6を介してmRNAの安定性に寄与する5′Cap構造やpolyA配列の分解酵素と相互作用してRISCを形成し，標的mRNAの分解を誘導する9）（図1）．近年，AGOとTNRC6の相互作用が相分離液滴の形成を促し，標的mRNAの分解を促進することが明らかになった10）．すなわち，AGOのPIWIドメインとTNRC6のGW-richドメインが相互作用して複合体が形成され，液-液相分離による相分離液滴が形成される．この液滴にはRISC複合体のほか，標的mRNAや脱アデニル化酵素が凝集しており，効率よくmiRNAによる標的mRNAの脱アデニル化が促進される．

さらに，miRNAは多様な塩基配列をもっており，それらの標的遺伝子に対する抑制効率はそれぞれ異なると考えられる．そこで，筆者らは機械学習を用いて高い抑制効果を示すmiRNAの特徴を解析した11）．その結果，①miRNA duplexの中央部の配列（ガイド鎖の5′末端から6〜14番目）が熱力学的に安定であり，②ガイド鎖の5′末端が不安定かつパッセンジャー鎖の5′末端が安定であり，③シード領域とmRNAとの塩基対合力が強い場合には，高い抑制効果を示すと考えられる結果が得られた（図2）．①はAGOへのローディング効率を上げるためと考えられ，②はAGOにローディングしたmiRNA duplexのうち，ガイド鎖の5′末端から一本鎖化しやすい構造をとることで，ガイド鎖がAGOタンパク質に係留されやすい状態になるためと考えられた．さらに③は，miRNAと標的mRNAが強く塩基対合することによって，標的遺伝子の抑制効率を高めるためと考えられた．

また，miRNAの3′末端はアデニル化やウリジル化修飾を受けることが知られており，近年，miRNAのウリジル化は標的mRNAの選択に関与することが報告された12）．ヒトmiRNAの3′末端がウリジル化酵素TUT4/7によりウリジル化されることで，アデノシンをもつこれまで結合できなかった標的mRNAと塩基対を形成し，miR27aの場合には抑制される標的mRNAが59％増加することが示されている．

このようにmiRNAによる標的mRNAの抑制効率は，塩基配列や，それに伴う熱力学的安定性，そしてリン酸化や液-液相分離，miRNAの3′末端のウリジル化などによって精巧かつ厳密に制御されている．さらには，標的mRNAの3′UTRに存在するmiRNAの対合サイトの場所や数などによっても，緻密に調節されていると考えられる．

二本鎖RNA結合タンパク質によるmiRNAの生合成制御

pre-miRNAはDicerによって切断されることで成熟化するが，このプロセスは二本鎖RNA結合タンパク質によって調節される13）．Dicerはより効率的に，そして特異的にpre-miRNAをプロセシングするために，TAR RNA-binding protein（TRBP）などの二本鎖RNA結合タンパク質と複合体を形成する．TRBPは二本鎖RNA結合ドメイン（double-stranded RNA binding domain：dsRBD）を2つもっており，pre-miRNAなどの基質となる二本鎖RNAの二本鎖領域に結合する．さらに，2つのdsRBDとよく似ているが二本鎖RNAに対する結合能がない3つ目のMedipalドメインをもち，Dicerへのリクルートを促進する．次に，Dicerはpre-miRNAが2塩基のオーバーハングをもっている場合は切断反応に進み，もっていない場合は迅速にTRBPが新たな基質の再配置を行う．このように，DicerとTRBPが共役して働くことで，pre-miRNAの正確でかつ効率的なプロセシングを可能にしている14）（図3A）．

その構造の類似性からTRBPとよく比較して研究されてきたタンパク質としてprotein activator of the interferon-induced protein kinase（PKR）（PACT）が挙げられる．PACTはTRBPと同様にDicerのプロセシングを促進するが15），異なる点も挙げられる．Dicer-TRBP複合体とDicer-PACT複合体は，同じpre-miRNAから異なる長さの成熟型miRNAを生成することが報告された16）17）．この現象はDicerの切断点が補因子であるTRBPやPACTとの相互作用によってずれることによって生じる．Dicerによる切断点がずれるとmiRNAのRNAサイレンシングに大きな影響を与える．特にpre-miRNAの3′側に位置するmiRNA（3pストランド）は，その5′末端の切断点が1塩基でもずれるとシード配列がずれるため，異なる種類の遺伝子群を制御することになる．またもともと二本鎖RNAの編集酵素として同定された二本鎖RNA結合タンパク質であるadenosine deaminase acting on RNA type 1（ADAR1）もDicerと相互作用することで，miRNAの成熟化を促進することが報告された18）．ADAR1はホモダイマー形成時にはRNA編集に，Dicerとのヘテロダイマー形成時にはmiRNAの生合成促進に寄与する．またADAR1はウイルス感染時などに産生されるインターフェロン（interferon：IFN）によって発現誘導されるADAR1p150というアイソフォームが存在し，ウイルス応答時に特定のmiRNAの成熟化を促進することも報告されている19）．さらに，筆者らはTRBPやADAR1のRNA immunoprecipitation sequence（RIP-seq）解析の結果，それぞれ優先的に結合するmiRNAには相違があることを報告している20）21）．つまり，TRBPやADAR1はそれぞれ異なる種類のmiRNAをDicerへとリクルートして成熟化させていると考えられる．このような違いを生み出す理由はdsRBDの基質選択性やpre-miRNAがもつさまざまなRNA二次構造（ミスマッチ塩基対やWobble塩基対，バルジ，インターナルループ等）20）に起因すると考えられている．

以上のように，miRNAは同一のpre-miRNAからのプロセシングの過程において，Dicerの働きを補助する二本鎖RNA結合タンパク質が複数存在することで，成熟化させるmiRNAの長さや種類を変えて，下流の遺伝子群の制御ネットワークを調節していると考えられる（図3B）．

miRNAによって制御されるウイルス応答機構

ここで，miRNA生合成因子の機能的変化が，miRNAを介して遺伝子発現を巧妙に制御することを示したわれわれの研究事例を紹介する．

哺乳類の体細胞において，ウイルスに感染した細胞では，自然免疫応答の1つであるIFN応答が誘導される．IFN応答時には，①感染細胞でのIFNの産生・分泌，②IFNを受容した細胞でのJanus kinase-signal transducer and activator of transcription（JAK-STAT）経路の活性化の2つのステップを経て，抗ウイルス機能をもつ遺伝子群の発現量が大きく変動する22）．これにより細胞内のウイルスの増殖が抑制される．この細胞内の抗ウイルス応答機構として，無脊椎動物や植物においてはRNAサイレンシング機構が用いられていることが示されていた．一方，哺乳類においてはIFN応答などの高度な生体防御機構が発達し，RNAサイレンシングは抗ウイルス機能とは無関係であると考えられていた．しかしながら，筆者らは，IFN応答時に発現上昇するウイルスセンサータンパク質の1つであるlaboratory of genetics and physiology 2（LGP2）がpre-miRNAの成熟化促進因子であるTRBPの機能を制御するという，IFN応答経路とRNAサイレンシング経路のクロストークがあることを発見した20）．すなわち，ウイルス感染前にはTRBP-Dicerの相互作用によってpre-miRNAの成熟化が起こっているが，ウイルス感染によってLGP2の発現量が増加すると，LGP2はDicerよりもTRBPと相互作用しやすいため，TRBP-Dicer からTRBP-LGP2へと置き換わり，TRBP-Dicer複合体によって成熟化していたpre-miRNAの成熟化が阻害される（図4）．そのため，TRBP結合型miRNAの標的遺伝子に対する発現抑制効果が弱まり，結果的に，それらの発現量を増加させると考えられた．実際に，TRBP欠損細胞とLGP2欠損細胞にセンダイウイルスを感染させてマイクロアレイ解析を行い，成熟化阻害が起こる野生型細胞でのみ発現量が増加し，TRBPおよびLGP2欠損細胞では増加しない遺伝子群を調べたところ，その遺伝子群のなかにはアポトーシス関連因子が多く含まれていることがわかった23）．したがって，TRBPはウイルス応答時には，アポトーシスを誘導するように働くと考えられた．さらに，アポトーシスが起こると，TRBPはアポトーシス誘導時に活性化されるCaspase-3に切断されることが明らかになり，一方でIFN応答を抑制しつつ，他方で小胞体ストレスを誘導し，IFN応答と細胞死誘導のバランスをとる役割を果たしているということも明らかになってきた24）．

他の研究グループにおいては，TRBPに限らず，Dicer，PACT，ADAR1などのmiRNA生合成にかかわる二本鎖RNA結合タンパク質が，ウイルスセンサーの役割を果たすRNA結合タンパク質〔例えばretinoic acid-inducible gene I（RIG-I），PKRなど〕と相互作用をする例も明らかになっている25）〜27）．これらRNA結合タンパク質間の相互作用はIFN応答を調節するとともに，miRNA群の生合成に影響を及ぼし，miRNA- mRNAの遺伝子発現ネットワークをも制御していると考えられる．ウイルスセンサータンパク質の一部はIFN応答時に，時間経過とともに発現量が大きく増加することも考えると，感染からの時間に応じた応答の切り替えなどに対し，miRNAが重要な役割を果たしている可能性が考えられる．

ターゲット指向型分解機構によるmiRNAの分解制御

近年，これまで述べてきたようにmiRNAが標的となるmRNAの分解を引き起こすのではなく，逆に標的mRNAがmiRNAを分解するターゲット指向型miRNA分解（target-directed miRNA degradation：TDMD）という機構が報告されている．TDMDはmiRNAが標的mRNAに通常とは異なる様式で結合したときに誘導される．すなわち，miRNAのシード領域に加えて，miRNAの3′末端側の約10塩基とも相補的に対合するという強固な結合をしたうえで，miRNAの中央領域はバルジ構造を取ることで誘導される（図5）．このような結合様式において，AGOタンパク質は構造変化を起こすことが結晶構造解析により示され，AGOタンパク質は通常とは異なるタンパク質複合体をリクルートすることが示唆された28）．その後，CRISPR-Cas9系を用いた遺伝子スクリーニングにより，より詳細なTDMDの分子メカニズムが明らかになった29）．そこでは，ユビキチンリガーゼファミリーであるCullin-RING ligase（CRL）複合体に含まれるzinc finger SWIM-type containing 8（ZSWIM8）を介してAGOタンパク質のユビキチン化が促進され，その後プロテアソームで分解されるというモデルが提唱された．この過程を経てmiRNAはAGOタンパク質から放出され，最終的にはヌクレアーゼによって分解される．

TDMDはウイルスの転写産物やmiRNA阻害剤であるTough Decoy RNAによって誘導されると考えられてきたが，近年さまざまな機能にかかわる内因性の転写産物によっても誘導されることが明らかとなった．例えば，神経再生に関連するneuronal regeneration-related protein（Nrep）とmiR-29b30），血栓溶解にかかわるserpin family E member 1（Serpine 1）とmiR-3031），長鎖ノンコーディングRNAであるCyranoとmiR-732）のペアリングでTDMDが誘導されることが報告された．Shkumatavaらの研究グループの報告によると30），miR-29bとの結合部位を含むNrepの3′UTRは脊椎動物に広く保存されており，この結合部位を欠損させたマウスでは小脳でmiR-29bが高発現し，小脳が司る運動学習に支障がみられた．一般的に成熟化したmiRNAはAGOタンパク質によって保護されているため，半減期が数時間から数日と細胞内で安定に存在している．そのため，AGOタンパク質の分解を誘導するTDMDは，個体レベルでの表現型にも影響を与える重要なmiRNA発現制御機構といえるだろう．

おわりに

miRNAは塩基配列の違いだけでなく，塩基対合の熱力学的安定性，RNAの二次構造などのきわめて複雑な機構を巧みに制御しながら，遺伝子発現を調節する．本稿において，このような精巧な調節機構のメカニズムについて述べてきたが，これらは20塩基程度の小さなRNA分子であるからこそ実現可能な機構と考えられる．miRNAによる遺伝子発現制御機構の理解は，これまで未解明であった未知の生命現象を理解する鍵となるかもしれない．

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浅野吉政：神戸大学理学部生物学科卒業．東京大学大学院理学系研究科（修士・博士課程）修了．マウス個体を用いたsiRNAの抗腫瘍効果の検証のほか，ウイルス感染時の分子間相互作用を研究（東京大学大学院理学系研究科程研究室助教）．現在，日本大学薬学部にて，マウスや細胞を用いたウェット技術とバイオインフォマティクス技術を駆使し，体内時計の生理的意義の解明をめざす．