クローズアップ実験法

2022年4月号 Vol.40 No.6 詳細ページ
生細胞の局在を反映した核可溶性画分の分画法
小川　泰
345 生細胞での局在を反映した 核可溶性画分の分画法 小川 泰 何ができるようになった? 核タンパク質を生化学的に解析するにあたり,いくつかの分画方法や市販のキットが開発されてい るが,完全な核内プロテオームを得る方法はまだない.特に,核内可溶性タンパク質は,分画の際に 失われることが多い.本方法は,より生細胞に近い組成で核可溶性画分を得るものである. 必要な機器・試薬・テクニックは? 主な必要機器は,血球計数盤,卓上の簡易遠心機,ブロックインキュベーター,ソニケーター,蛍 光顕微鏡等である.必要試薬類は,ほとんどのものが購入可能である. はじめに 原理 核タンパク質の分画は 1960 年代から行われており, 細胞質画分と核画分の分画法は,一般的に,細胞膜 当初は低張液によって細胞を膨張させ,ホモジナイザー の選択的破壊による細胞質画分の溶出と,核膜の破壊 によって細胞膜を破裂させ,ショ糖密度勾配遠心法に による核画分の溶出という ,たったの 2 段階のステッ 1) より核を分離していた .その後 ,界面活性剤を用い プで行われる(図 1).一見簡単に思えるが,3 つの注 た,より簡略化された方法が広く使われるようになり, 意すべき点がある.1 つ目は,多くの核 - 細胞質間輸送 今ではさまざまな分画キットが販売されている.しか は温度依存的であり,氷上のような低温で分画操作を し,これら市販のキットを用いて分画された核画分は, 行うと本来の局在から変化するタンパク質が存在する 一部の可溶性核タンパク質が失われていたり,細胞質 点である 2).そのため ,最初の細胞膜の選択的破壊は 等の他の画分からのコンタミネーションを多く含んで 25 ∼ 37 ℃程度で行うことが望ましい.2 つ目は,細胞 いたりすることがわかった.本稿では,これまでの方 膜を破壊する際,核膜の完全性を維持することである. 法よりも,より生細胞の局在を反映した可溶性核タン このステップで核膜を損傷すると,核内可溶性タンパ パク質の分画方法を解説する. ク質は核外へ流出してしまう.市販の分画キットの多 くは,この部分に問題が多いように思える.3 つ目は, 細胞膜を選択的に破壊し,核膜の完全性が維持されて いても,比較的低分子量の核タンパク質が漏出する点 Fractionation methods of nuclear soluble fractions reflecting localizations in live cells Yutaka Ogawa:Cellular Dynamics Laboratory, RIKEN Cluster for Pioneering Research(国立研究開発法人 理化学研究所 開拓研究本部 今本細胞核機能研究室) 実験医学 Vol. 40 No. 6(4 月号)2022 933
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