カラーイラストで遺伝子工学のしくみを解説した定番テキスト.使用頻度が減った実験手法は簡略化し,代わりにゲノム編集やNGS,医療応用面を強化.実験で手を動かす前に押さえておきたい知識が無理なく身につく.
目次
第3版の序
第2版の序
初版の序
概説 遺伝子工学 ―誕生から今日まで,そして未来へ
1.遺伝子工学とは
2.最初の遺伝子工学実験とその意味
3.遺伝子工学を発展させたエポック
4.遺伝子工学はどのように活かされているか
5.遺伝子工学の未来
第Ⅰ部 遺伝子・DNAの基礎
1章 遺伝子工学で使われる生物
1.遺伝子工学で生物を用いる目的
2.原核生物と真核生物
❶原核生物 ❷真核生物
3.ゲノムと遺伝子
❶遺伝子 ❷ゲノムと含まれる遺伝子
4.大腸菌
❶特徴 ❷遺伝子型 ❸培養 ❹滅菌
5.遺伝子工学に登場する真核生物
❶酵母 ❷多細胞動物個体 ❸植物 ❹培養動物細胞
6.遺伝子工学に利用される動物ウイルス
❶ウイルスとは ❷使用される主なウイルス
章末問題
2章 DNA:化学構造,複製,構造変化
1.DNAの構造
❶DNAはヌクレオチドが連結した分子 ❷細胞のDNAは二本鎖として存在する
2.DNAの構造変化
❶一本鎖と二本鎖の間の変換 ❷切断,剪断
3.DNAの複製
❶DNA合成反応の原則 ❷細胞内で起こるDNA複製 ❸DNAポリメラーゼ ❹試験管内DNA合成
4.DNAのメチル化
❶メチル化部位 ❷原核生物でのメチル化
5.DNAの変異,損傷,修復,および組換え
❶DNAの変異 ❷DNAの損傷 ❸損傷DNAの修復 ❹DNAの組換え
章末問題
3章 遺伝子の発現
1.RNA
❶RNAとは ❷RNA機能の多様性 ❸遺伝子発現制御能をもつncRNA ❹RNAのそれ以外の機能
2.転写機構
❶RNA合成:RNAポリメラーゼ ❷転写開始 ❸転写終結まで
3.原核生物の転写制御
❶ポリシストロニック転写とオペロン ❷ラクトースオペロンの構造と制御機構 ❸lacオペロンのグルコース効果
4.真核生物の転写制御
❶エンハンサーと転写制御因子 ❷制御のメカニズム
5.転写後のできごと:RNAの加工と成熟
❶mRNAの末端修飾 ❷スプライシング ❸その他の加工
6.アミノ酸,ペプチド,タンパク質
❶アミノ酸 ❷ペプチド結合 ❸タンパク質
7.翻訳
❶コドンとtRNA ❷翻訳機構
8.真核細胞で翻訳されたポリペプチドの運命
❶翻訳後のタンパク質 ❷タンパク質の分解
章末問題
第Ⅱ部 基本の酵素からクローニングまで
4章 制限酵素,DNAメチラーゼ,DNAリガーゼ
1.細菌がもつ自己防衛手段:制限と修飾
❶現象の発見 ❷制限修飾の実体
2.制限酵素発見の意義
3.制限酵素の種類
❶Ⅰ〜Ⅲ型酵素 ❷制限酵素の分布
4.Ⅱ型制限酵素の反応特性
❶認識配列と切断部位 ❷反応様式と切断面 ❸制限酵素のスター活性
5.DNAメチラーゼと制限酵素の切断特性
❶制限修飾系でのメチル化 ❷大腸菌で増やしたDNAのメチル化に関する注意
6.ホーミングエンドヌクレアーゼ
7.粘着末端を利用したDNAの連結
❶DNAの付着と連結 ❷DNAリガーゼ反応の実際 ❸同一粘着末端をもたないDNA末端の連結方法
章末問題
5章 核酸の合成,分解,修飾に関する酵素
1.DNA合成酵素
❶通常のDNA合成用DNAポリメラーゼ ❷クレノー断片 ❸特殊な用途で使われるDNA合成酵素
2.核酸分解酵素
❶核酸分解酵素の区分 ❷DNAに働くエンドヌクレアーゼ ❸DNAに働くエキソヌクレアーゼ ❹一本鎖特異的ヌクレアーゼ ❺RNAを分解する酵素:リボヌクレアーゼ(RNアーゼ)
3.DNAの平滑末端化
4.末端リン酸基の脱着
❶リン酸基の脱着 ❷リン酸基脱着反応を遺伝子操作の中で応用する
5.組換えDNAからのin vitro RNA合成
章末問題
6章 プラスミド,ファージ,トランスポゾン
A.プラスミド
1.プラスミドの概要
❶プラスミドの複製とコピー数 ❷不和合性
2.大腸菌のプラスミド
❶ColE1 ❷R因子 ❸F因子
3.その他のプラスミド
❶Tiプラスミド ❷他の細菌プラスミド ❸出芽酵母のプラスミド
B.大腸菌のファージ
4.ファージの種類と増殖
❶ファージとは ❷ファージの一般的性質 ❸ファージの検出と定量:プラークアッセイ
5.λファージ
❶増殖:溶菌サイクル ❷溶原化サイクル
6.一本鎖ファージ:M13
❶概要と増殖 ❷利便性
C.トランスポゾン
7.概要
8.DNAトランスポゾン
9.レトロトランスポゾン
章末問題
7章 ベクター ―DNAの導入,増幅,発現,組込みのツール
A.ベクターの基本
1.ベクターとクローニング
❶ベクターとは ❷ベクターの使用目的と材料別ベクターの種類 ❸ベクターとしての要件 ❹クローンとクローニング
2.選択マーカー
❶マーカーの意義と原理 ❷検出方法によるマーカーの分類
3.ベクターの能力にかかわる機能性配列
❶マルチクローニング部位 ❷制御配列
B.原核生物のベクター
4.主な選択マーカー
❶抗生物質に対する耐性遺伝子:薬剤耐性遺伝子 ❷lacZ遺伝子と青白選択 ❸致死ベクター
5.大腸菌のプラスミドベクター
❶古典的・標準的なプラスミドベクターと使われる菌株 ❷多用途汎用ベクター ❸特定の目的で使用されるベクター
6.遺伝子発現用の大腸菌プラスミドベクター
❶遺伝子発現の基本戦略 ❷大腸菌内での発現の方策
7.大腸菌用ファージベクター
❶λファージ由来の一般的クローニングベクター ❷λファージ由来発現ベクター ❸M13ファージベクター ❹混成ベクター
C.真核生物のベクターとマーカー
8.真核細胞中での発現制御系
❶真核細胞で使われるプロモーター ❷転写後シグナルと翻訳シグナル
9.真核細胞で利用されるマーカー
❶薬剤耐性遺伝子 ❷代謝欠陥を補う遺伝子 ❸致死遺伝子 ❹レポーター遺伝子
10.酵母・真菌のベクター
❶ベクターのタイプ ❷マーカー遺伝子 ❸カウンター選択
11.動物細胞用ウイルスベクター
❶レトロウイルスベクター ❷レンチウイルスベクター ❸アデノウイルスベクター ❹その他の動物ウイルス
D.トランスポゾンベクター
12.トランスポゾンベクター
❶概要 ❷DNA型トランスポゾンベクターの使い方と特徴 ❸動物細胞で使われるベクター
章末問題
8章 DNAクローニング ―新規クローンの単離とサブクローニング
A.古典的なゲノムDNAのクローニング法
1.古典的DNAクローニングの概要
2.ゲノミッククローニングの実際
❶ベクターの選択 ❷ライブラリー用DNAの調製 ❸目的クローンの選択 ❹PCRによる選択
B.古典的cDNAクローニング法
3.cDNAライブラリーの作製
❶ライブラリー作製の要点 ❷特異的cDNAの濃縮
4.cDNAに特異的なクローン選択法
❶結合性に基づく発現クローニング ❷機能性クローニング
C.ポストゲノム時代の遺伝子クローニング
5.現在のクローニング戦略
❶クローニング戦略の変化 ❷ゲノムDNAのクローニング ❸cDNAクローニング
D.組換えDNAの再構築:サブクローニング
6.標準的なサブクローニング戦略
❶サブクローニングとその手順 ❷DNAリガーゼによるベクターとDNA断片の連結
7.新しいPCR産物クローニング法
❶末端の特別な構造を介する組換え体の構築 ❷シームレスクローニング
E.重要なDNA構築技術
8.オリゴヌクレオチド
9.部位特異的変異の導入
❶概要 ❷Dpn Ⅰを使って変異DNAを作製・濃縮する方法
10.cDNAの合成
❶真核生物mRNAの調製 ❷cDNAの合成
F.細胞へのDNA導入
11.原核生物(大腸菌)へのDNA導入
❶プラスミドによる形質転換 ❷ファージ感染 ❸目的クローンの選別と決定
12.動物細胞への核酸導入
❶トランスフェクション ❷ウイルスベクターを用いる方法
13.植物細胞への導入:Tiプラスミドを使う方法
章末問題
9章 タンパク質産生制御系
1.真核生物タンパク質の発現・産生
❶原核細胞での発現 ❷真核細胞での発現
2.大腸菌でタンパク質をつくる場合の注意点
❶塩基配列とコドンバイアス ❷不溶タンパク質の可溶化と不溶化防止策 ❸発現させるタイミングを工夫する
3.融合タンパク質の作製
❶β-ガラクトシダーゼ(β-gal)融合タンパク質 ❷タグ付きタンパク質とその精製 ❸ファージディスプレイ
4.T7 RNAポリメラーゼ発現系
❶pETベクター ❷発現制御系:pETシステム
5.真核生物でのタンパク質発現
❶真核細胞発現ベクターに求められる要素 ❷バキュロウイルス発現系 ❸テトラサイクリンによる発現制御系(Tetシステム)
6.遺伝子工学で使われるタンパク質分解酵素
章末問題
第Ⅲ部 核酸の取り扱いと構造機能解析
10章 核酸の取り扱いと検出
A.取り扱い
1.核酸の物理化学的性質
❶核酸一般の性質 ❷DNA特有の性質 ❸RNA特有の性質
2.DNAの調製
❶細胞からのゲノムDNAの抽出 ❷細菌からのプラスミド抽出 ❸細胞から抽出したDNAの精製
3.RNAの扱い:常に「分解阻止」を念頭に置く
4.核酸の濃縮
❶核酸のエタノール沈殿 ❷その他の濃縮法
B.核酸同士の分離
5.ゲル電気泳動による核酸の分離
❶ゲルの素材と形状 ❷通常ゲル(中性ゲル)による電気泳動 ❸変性ゲルによる電気泳動 ❹特別な目的のために行う電気泳動 ❺ゲルからのDNA抽出
6.超遠心分離による核酸の分離
C.核酸の視覚的検出と定量
7.蛍光を用いて核酸を視覚化する
❶概要 ❷核酸検出法
8.核酸の紫外部吸収
❶核酸の定量 ❷核酸の純度
D.ハイブリダイゼーションによる核酸配列の探査
9.ハイブリダイゼーション探査の概要
10.核酸ハイブリダイゼーションの基礎
❶Tmに影響を与える要因 ❷ハイブリダイゼーション実施条件
11.プローブの作製:DNAの標識
❶DNAのRI標識法 ❷非RI標識DNAの調製
12.標識プローブの検出
❶RIプローブの検出:オートラジオグラフィー ❷非RIプローブの検出
13.ハイブリダイゼーション検出の実際
❶サザンブロッティング(RIプローブを使う例) ❷ノーザンブロッティング ❸基盤付着DNAの検出 ❹in situハイブリダイゼーション
章末問題
11章 PCRによるDNAの増幅
1.PCRの原理と概要
2.材料と反応条件
❶プライマーの設計 ❷耐熱性酵素の選択 ❸反応液とサイクルプログラム ❹ホットスタートPCR ❺修飾温度サイクリング
3.遺伝子工学におけるPCRの利用
❶PCRの基本的な使われ方 ❷微量DNA中の特定配列検出への応用 ❸DNAシークエンシングへの応用 ❹RNAの検出 ❺新たな構造をもつDNAの作製 ❻クロマチン結合タンパク質の検出
4.PCR産物の直接クローニング/サブクローニング
5.リアルタイムPCR
❶リアルタイムPCRとは ❷蛍光検出系 ❸DNAが定量できる原理
6.デジタルPCR
❶原理 ❷概要と応用
7.PCRによらないDNA増幅法
❶概要 ❷非PCR DNA増幅の要点 ❸ICAN法 ❹LAMP法 ❺RCA法 ❻SATIC法 ❼SmartAmp法
章末問題
12章 DNAシークエンシングとゲノム解析
1.ジデオキシ法によるマニュアルシークエンシング
❶原理 ❷一本鎖鋳型DNAの準備 ❸反応,電気泳動,検出 ❹現在までに改良された点(昔のものから順に)
2.DNAシークエンサー(第一世代シークエンサー)
3.標準的次世代シークエンサー:NGS
【A】第二世代シークエンサー ❶PCR増幅と均一DNA集団の形成 ❷反応系
【B】第三世代シークエンサー
【C】NGSを活用する ❶NGSを使用するまでの操作フロー:ライブラリー作製 ❷NGSの応用
4.第四世代NGS:ナノポアシークエンサー
❶どういうものか ❷検出の概要と使い方 ❸利便性,応用性,発展性
5.ゲノム解析
❶NGS以前 ❷NGS以後
章末問題
13章 遺伝子発現と遺伝子産物の解析
1.内在性遺伝子の発現状態の解析
❶RNAやタンパク質の構造決定や同定の戦略 ❷特定のRNAの検出・解析・同定 ❸RNAの網羅的解析 ❹タンパク質の検出・同定
2.シングルセル解析
❶概要 ❷解析のプラットフォームとscRNA-Seqの実施
3.細胞を使った遺伝子の発現機能解析
❶導入遺伝子の一過的発現と安定発現 ❷レポーターアッセイとその応用:転写系を利用した解析
4.in vitroでの遺伝子発現解析と遺伝子産物合成
❶in vitro転写 ❷細胞抽出液による伝統的in vitro翻訳 ❸PUREシステム:再構成遺伝子発現系
5.タンパク質-核酸相互作用の解析
❶in vitro反応による方法 ❷細胞内での相互作用の検出
6.タンパク質同士の結合の解析
❶免疫沈降-ウエスタンブロッティング法 ❷結合能をもつタグ付きタンパク質を使う方法
❸細胞を使う方法 ❹ファーウエスタン法 ❺結合タンパク質を網羅的に検索するその他の方法
7.イメージング解析
❶光学顕微鏡とその発展形 ❷電子顕微鏡 ❸走査型プローブ顕微鏡
章末問題
14章 エピゲノムとその解析
A.クロマチンとエピゲノム
1.クロマチンの基本構造
❶クロマチンとは ❷ヌクレオソームとヒストン ❸ヌクレオソーム形成反応 ❹高次クロマチン構造:クロマチンの階層的折り畳み
2.エピゲノム:修飾されたクロマチン
❶DNAのメチル化 ❷ヒストンの化学修飾 ❸ヌクレオソームアレイの変更 ❹クロマチン会合分子
3.エピジェネティクス
❶ゲノムインプリンティング ❷X染色体不活化 ❸遺伝子の位置効果による斑入り
B.クロマチン,エピゲノムの解析
4.解析方針
5.メチル化DNAの検出
❶メチル化DNAの分離・調製 ❷メチル化DNA配列の同定
6.クロマチンタンパク質の解析
❶解析の概要 ❷個別部位における結合タンパク質の解析:ChIPアッセイ ❸結合部位の網羅的同定
7.高次クロマチン構造の解析
❶古典的なクロマチン分析法 ❷オープンクロマチン領域の解析 ❸3C法およびその関連法
章末問題
第Ⅳ部 遺伝子工学の応用と安全性の確保
15章 ゲノム工学と関連技術
1.ゲノム工学とは
A.遺伝子導入個体の作出とそれに付随する技術
2.遺伝子導入(トランスジェニック)個体の作製
❶作製法 ❷トランスジェニック実験の評価
3.植物の生命工学
❶植物を対象とする生命工学 ❷植物細胞への遺伝子導入 ❸植物に特有な問題
B.ゲノムを狙った通りに改変する技術
4.遺伝子ターゲティング
❶概要 ❷条件(コンディショナル)ノックアウト
5.ゲノム編集
❶背景と概要 ❷初期に開発された方法 ❸現在の主流:CRISPR/Cas9法 ❹CRISPR/Cas9法の課題
6.新しい時代のCRISPR/Cas9利用法
❶基盤技術の進歩 ❷Cas9をニッカーゼとして使う ❸トランスポゾンとの相互作用を利用する ❹エフェクターの多様な機能を利用する ❺因子集積プラットフォームとして使う
章末問題
16章 小型核酸による細胞機能の特異的制御
A.総論
1.特異的細胞制御因子としての小型核酸
❶概要 ❷使い方
2.使用に関する基本的留意点
❶分解抵抗性付与 ❷細胞移入法 ❸オフターゲット効果
B.各論
3.アンチセンス核酸
❶概要 ❷作用機構 ❸分子デザイン ❹ヘテロ二本鎖としての使用
4.siRNAとRNA干渉
❶RNA干渉:始まりと概要 ❷遺伝子ノックダウン ❸遺伝子抑制機構 ❹siRNAのデザイン ❺shRNAによる恒常的遺伝子抑制
5.マイクロRNA
❶マイクロRNA(miRNA)とは ❷miRNAにかかわる核酸医薬
6.アプタマー:結合性核酸
❶アプタマーの発見 ❷改良や応用
7.リボザイム
8.デコイとしての使用
9.自然免疫賦活化活性をもつCpGオリゴ
章末問題
17章 医療における遺伝子工学
A.医薬
1.新規創薬モダリティの移り変わり
2.抗体医薬
❶免疫療法 ❷単クローン抗体とその作製 ❸単クローン抗体のヒトへの適用 ❹抗体の医薬としての使い方 ❺抗体医薬の進化
3.核酸を医薬として使う
❶核酸医薬というモダリティ ❷薬剤の組織デリバリー(送達) ❸毒性
4.核酸ワクチン
❶ワクチンとは ❷核酸ワクチンの多様性
B.治療
5.遺伝子治療
❶遺伝子治療という選択肢 ❷遺伝子治療の経緯 ❸遺伝子導入のためのベクター ❹遺伝子改変T細胞療法 ❺その他の取り組み
C.細胞の脱分化・分化・移植
6.幹細胞工学,組織工学,再生医療
❶分化,幹細胞,再生 ❷人工的な多能性幹細胞 ❸多能性幹細胞を使う再生医療 ❹分化細胞の移植に関する課題 ❺iPS細胞を用いるその他の取り組み
D.新しい時代の生命科学
7.膨大なデータに基づく生命科学
❶シングルオミクスからトランスオミクスへ ❷生命情報に基づく医学・医療 ❸最新生命科学研究の潮流
章末問題
18章 遺伝子操作における安全性確保:カルタヘナ法
1.遺伝子組換え実験の自己規制
2.カルタヘナ法の成立
❶その後の経過 ❷カルタヘナ議定書 ❸法令で使用される用語の意味 ❹法令に規制されない遺伝子組換え実験
3.遺伝子組換え生物の使用と実験分類
❶遺伝子組換え生物等(LMO)の使用形態と実験の申請 ❷機関承認実験と大臣確認実験 ❸実験分類
4.実験の種類と拡散防止措置
❶実験の種類 ❷拡散防止措置
5.留意すべきこと
章末問題
付録
索引
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- 【本書名】基礎から学ぶ遺伝子工学 第3版
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