クローズアップ実験法

2022年6月号 Vol.40 No.9 詳細ページ
Split-GFPプローブを用いた生細胞におけるオルガネラコンタクトサイトを可視化・定量する技術
田村　康，田代晋也
347 Split-GFPプローブを用いた 生細胞におけるオルガネラコンタク トサイトを可視化・定量する技術 田村 康,田代晋也 何ができるようになった? オルガネラコンタクトの解析は ,電子顕微鏡解析などの細胞の固定化を介する方法が一般的で ,その 動態解析は困難であった.本 Split-GFP プローブを用いることで,生きた細胞のオルガネラ間コンタクト を簡便に可視化し,その動態を解析することが可能になった. 必要な機器・試薬・テクニックは? 出芽酵母や培養細胞への遺伝子導入技術と培養装置に加え,蛍光顕微鏡が必要である.また条件し だいでフローサイトメーターを用いた解析が可能である.本 Split-GFP プローブ発現プラスミドは理 研 BRC から入手できる. はじめに れらの問題点を克服し,オルガネラコンタクトを生き 近年,オルガネラコンタクトサイト(オルガネラ間 た細胞で,簡便に,感度よく検出できる.さらにライ の接触部位)が,脂質やイオンなどの物質輸送,ミト ブセルイメージングによりその動態を追跡可能な実験 コンドリア分裂,オートファジー,アポトーシス,UPR 手法である. 応答などといった多彩なイベントに関与することが報 告され,その機能が注目されている 1). オルガネラコンタクトサイトの観察や定量は,電子 原理 顕微鏡解析,Proximity Ligation Assay といった方法 Split-GFP はその名の通り,GFP を 2 つに分割した が主流であるが,これらの方法では,細胞を固定化し タンパク質である.GFP を構成する 11 本のβストラン なければならず,生細胞におけるオルガネラコンタク ドのうち,N 末端側 10 本(GFP1-10)と,C 末端側の 2) トの動態を解析することは不可能である.FRET や 3) ddFP (dimerization-dependent fluorescent protein) 1 本のβストランド(GFP11)で分割した組合わせが, タンパク質間相互作用の検出に使用されている 4).わ を用いて,生細胞でオルガネラコンタクトを解析した れわれは,この Split-GFP をオルガネラコンタクトの 報告もあるが,少なくともわれわれが行った限りでは, 可視化に利用可能であることを見出した 5)6).原理は単 検出感度が低いという問題点があった. 純で,GFP1-10,GFP11 それぞれを,異なるオルガネ 今回われわれが確立した Split-GFP プローブは,こ ラ膜に発現させるだけである(図 1).単純ではあるが, Visualization of interorganelle contact sites using Split-GFP probes Yasushi Tamura/Shinya Tashiro:Faculty of Science, Yamagata University(山形大学理学部理学科) 実験医学 Vol. 40 No. 9(6 月号)2022 1449
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