改訂　細胞・組織染色の達人

◆改訂の序

◆初版の序

◆動画視聴のご案内

序 章　染色をはじめる前に考えること

1　免疫染色とin situ Hybridization

2　蛍光か発色か？

3　染色をはじめるにあたって，最初に考えること

第1章　動物の解剖と固定

1　動物実験をはじめる前に

1　適切な動物実験を行うための一般原則

2　適正な動物飼育を行うための動物福祉

3　マウス・ラットの試料採取に必要な麻酔薬と安楽死処置

4　人道的エンドポイント

5　最後に

2　切片・固定液の種類と器具の準備

1　切片の種類

2　動物の解剖～切片作製までの流れ

3　固定液の種類と組成

4　解剖，灌流固定に用いる実験器具

3　解剖，灌流固定法の実際

1　灌流固定か，浸漬固定か？

2　灌流固定の方法

第2章　組織のサンプリング

1　灌流固定を必要とする組織

1　脳

2　下垂体

3　脊髄

4　後根神経節

5　肝臓

6　腎臓，副腎

7　膵臓

8　脾臓

9　気管＋甲状腺

10　胸腺

11　唾液腺

12　舌（有郭乳頭）

13　白色脂肪，褐色脂肪

14　子宮，卵巣

15　乳腺

2　灌流固定を必要としない組織

1　胃，十二指腸

2　小腸，大腸

3　腸管ロール

4　皮膚

5　眼

6　骨組織①：大腿骨

7　骨組織②：膝関節

8　骨組織③：内耳（蝸牛）

9　骨組織④：歯（下顎）

10　血管

11　胎仔，新生仔，胎盤

12　筋肉

13　精巣，精巣上体

14　ゼノグラフト，ヒト・大動物組織など

3　どちらでもよい組織

1　心臓

2　骨髄

3　膀胱

4　肺

4　培養細胞のサンプリング

1　調製方法の種類と選び方

2　プロトコール

3　染色例

第3章　ブロック作製

1　組織の前処理

1　パラフィン包埋のための固定後の処理

2　脱脂

3　脱灰

2　パラフィンブロックの作製（包埋）

1　パラフィン包埋

2　ブロックの成形

3　パラフィンブロックの保存

3　凍結ブロックの作製

1　未固定凍結ブロックの作製

2　既固定凍結ブロックの作製

3　凍結ブロックの保存

第4章　薄切

1　パラフィン切片の作製と保存

1　切片の厚み

2　パラフィン切片作製の手順

3　パラフィン切片の保存

2　凍結切片の作製と保存

1　凍結切片作製時の温度・厚さ

2　凍結切片作製の手順

第5章　免疫組織化学染色

1　抗体を選ぶ

1　抗体の候補を検索

2　候補の絞込

3　Q&A

2　染色の流れ

1　条件検討に用いる切片の準備

2　脱パラフィン～前処理（抗原賦活化，各種ブロッキングなど）

3　一次抗体反応

4　検出系

3　免疫染色の準備

1　器具

2　試薬（LSAB法）

3　ABC法，ポリマー法，mouse on mouseで使用する試薬

4　免疫染色プロトコール（LSAB法）

1　作業前の準備

2　プロトコール

3　簡易プロトコール

5　染色結果を評価する

1　免疫染色の条件検討

2　免疫染色の答え合わせ

6　二重染色

1　二重染色の条件検討

2　二重染色の手順

第6章　蛍光免疫組織化学染色

1　抗体を選ぶ・条件検討

1　一次抗体を選ぶ際の注意点

2　蛍光標識の二次抗体

3　条件検討

2　蛍光免疫染色の準備

1　器具

2　試薬

3　蛍光免疫染色プロトコール

1　作業前の準備

2　プロトコール

3　染色例

第7章　in situ ハイブリダイゼーション（ISH）

1　ISHの原理

1　プローブの種類

2　ISHの手順

3　染色のコントロールのとり方

2　プローブの設計

1　設計の注意点

2　設計方法

3　プローブを作製する

1　設計した遺伝子配列の増幅

2　プローブ領域のクローニング

3　in vitro transcription反応によるDIG標識RNA合成

4　ドットブロット法によるプローブの濃度測定

4　ISH染色

1　準備

2　染色条件の設定

3　プロトコール

4　染色例

第8章　多重染色，その他の染色

1　ISH（発色）＋免疫染色（発色）

1　二重染色の条件検討

2　二重染色の手順

2　HE染色

1　試薬

2　プロトコール

3　TUNEL染色

1　TUNEL染色の原理

2　プロトコール

4　その他の特殊染色

1　シリウスレッド染色

2　マッソントリクローム染色

3　クリューバー・バレラ染色

4　トルイジン青染色

5　PAS染色

第9章　画像解析

1　バーチャルスライドによる染色画像の取得

1　ImageJとHALOの比較

2　バーチャルスライドによる染色画像の取得

3　スキャンした画像の閲覧

2　ImageJを用いた陽性部位の面積測定

1　解析画像の準備

2　ソフトのインストール

3　色分解により測定したい色を抽出する

4　面積を測定する

5　複数画像の測定の際に単位を合わせたい場合

3　HALOを用いた陽性部位の面積測定

1　画像解析の手順

2　解析結果の確認

◆索引

達人への一歩

①サンプルや染色方法によって固定液を選ぶ

②大切なシグナルを失わないための灌流固定

③灌流固定による組織の形態の変化

④PCR法を用いたマウス胎仔の性判別法

⑤溶剤の使い回しはほどほどに

⑥RNaseにはどこまで気をつければ良いのか？

⑦湿度が染色の成否を左右する？！

⑧スライドガラス変われば染色像変わる

⑨使える抗体はGoogle先生に聞こう

⑩DABの発色を見えやすくする

⑪二重染色ができない組み合わせの抗体について

⑫臨床検体でのISH

⑬ISHのネガコンはセンス鎖のみでよいのか？

⑭プラスミドからのRNA合成用鋳型調製

⑮プローブのアルカリ処理に要注意

⑯最適なProK濃度の探し方

⑰ハイブリチャンバーの気密性と湿度調節

⑱長すぎるハイブリ時間にご用心

⑲ISH発色停止のタイミング

⑳カウンターステインの種類とコツ

㉑ISHの検出感度と遺伝子の発現分布

㉒核酸医薬や遺伝子治療の分野におけるISH

㉓その細胞，ヒト由来？マウス由来？

㉔組織染色で死細胞を判断する新しい指標？

㉕空間トランスクリプトーム解析用の品質確認

㉖古代試料DNAが残っている細胞はどれ？

㉗細胞数計測？ 面積測定？

㉘線維化の面積測定：マッソントリクロームvsシリウスレッド