Q19. メンブレンのバックグラウンドは見えますが，バンドは全く見えません…

A．一次抗体を濃くするか，新しい一次抗体を使おう: メンブレンのバックグラウンドが見えているということは，二次抗体や検出液には問題がない可能性が高い．バンドが見えないということは一次抗体が薄いか弱っている．抗体は凍結融解で力価が著しく低下する．また，防腐剤や安定剤がないと４℃保存でも数カ月程度で力価が低下する．
A．電気泳動にアプライしたタンパク質量が少ない可能性があるので，アプライするサンプルを増やすか濃縮するかしよう: 検出感度以下の量しか目的タンパク質が存在しない場合，当然見えない．核局在性タンパク質の場合などは，細胞ホモジネートのアプライでは見えない場合でも，核抽出サンプルのアプライでは検出可能になることも多い．このように何らかの方法で濃縮を試みる．
A．一次抗体の反応性が悪い可能性があるので，違う一次抗体を使ってみよう: 内因性の微量タンパク質などの場合，よほど強い抗体でないと見えないのがふつうである．特に市販抗体は使用用途に制限があるものも多い．文献等で同じような検出条件で検出例がある抗体であれば，期待できる．
A．ブロッキング液の組成や濃度を確認し，必要に応じて変更してみよう: ブロッキングが強すぎる場合も，バンドが検出できなくなる．一般に汎用されるブロッキング剤のなかでは，スキムミルクが一番ブロッキング力が強い．そこで，スキムミルク濃度を下げてみたり（例：５％から２％など），スキムミルクの代わりにBSAや市販の合成ブロッキング剤を使ってみるなど工夫してみる．
A．ブロッキングの時間を変更してみよう: ７ブロッキング時間が長すぎる場合も，バンドが検出できなくなる（オーバーブロッキング）．通常，ブロッキングは室温１時間で十分である．実験の都合で一晩ブロッキングすることもあるが，一般に反応は弱くなる．２日以上ブロッキング液に浸けておくと反応は著しく低下する．
A．抗体反応促進剤を使ってみよう: 抗体反応を促進させる試薬がいくつかのメーカーから販売されている（TOYOBOのCanGet Signalなど）．これを用いることによって，検出できなかったバンドが検出できるようになる場合がある．ただし，二次抗体を希釈する等の至適化の必要がある．

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プロフィール

森山　達哉（Tatsuya Moriyama）

京都大学農学部食品工学科卒．同大学院農学研究科修士課程，博士課程ののち，京都大学食糧科学研究所助手　等を経て2005年に近畿大学農学部講師，2008年准教授．その間，1996年米国スタンフォード大学招聘研究員（１年間）．毎日多くの元気な学生たちと一緒に，食品成分の生理機能性（特に脂質代謝への影響）と安全性（特にアレルゲン性）に関する研究を行っている．基礎研究だけでなく，社会の役に立つ「アウトプット」を意識した研究を進めています．

＜著作＞