どこでも　誰でも　より長く　ナノポアシークエンサーが研究の常識を変える！

近年の分子生物学の発展は，DNAシークエンサーの技術革新に負うところが少なくない．そのDNAシークエンサーに新たな革新が起きている．DNA がタンパク質微細孔（ナノポア）を通過する際の電流変化によって配列決定を行うナノポアシークエンサーは，手のひらに乗るほどに小型でポータブルであり，大きな初期投資を必要とせず，またリアルタイムに数十kbpという長鎖DNAを読みとれるなど，従来のシークエンサーと一線を画す革新的デバイスだ．まだ市場に出て間もないため，発展途上にある技術だが，すでに多くの可能性を見せつつある．ナノポアシークエンサーがわれわれの研究をどう変えるのか，その可能性を展望したい．

Oxford Nanopore Technologies Ltd（ONT社）より2015年から販売されている手の平サイズのDNA/RNAシークエンサーMinION（ミナイオン）は従来にない数百キロの長さのリード長や，蛍光物質やレーザーを使用しない超小型サイズ，RNAをダイレクトにシークエンスでき，リアルタイムでのデータ取得と解析が行えるなど，ユニークな特徴を備えたシークエンサーとして生命科学，医学，農学，そしてフィールドでのシークエンスへと応用を広げている．ONT社では，同様のケミストリを使った大型シークエンサーの開発も行っており，これらのユニークな特徴を大型ゲノムへの解析に活かし新しい道を切り開く技術となりつつある．

MinIONシークエンサーより得られたリード（MinIONリード）向けの解析ツールは非常に速いテンポで開発が進められており，数カ月単位で目まぐるしく変化する状況を捉えるのが難しくなっている．本稿では，われわれが開発しているアライメントツールminialignを中心に，MinIONリード向けのアライメントツールで主なものをわれわれの独断と偏見で紹介する．その他のツール（de novoアセンブラ，コンティグの塩基エラー訂正ツール，その他のユーティリティ）についても，MinIONリードに実用可能なツールをまとめた表を掲載する．

近年，ナノポアシークエンサーによる1 分子長鎖（ロングリード）型シークエンシング技術の革新により，超長鎖DNA配列（～1 Mbp）の解読，RNA配列の直接解読，メチル化などの修飾塩基の検出などが可能になってきた．これらの技術は，細菌の染色体やプラスミドを含む完全配列の解析に加え，新たなmRNA 発現解析（mRNAや16S rRNA のDirect RNA-Seq など），新たなエピジェネティクス解析（メチル化RNA の検出など）により未知の生命現象を明らかにする可能性を秘めている．なかでも携帯性に優れたOxford Nanopore technologies（ONT）社のMinION においては，もはや研究を行う場所に制限はなく，2017年8月20日にわが国でも批准がはじまった名古屋議定書発効後の地域固有の遺伝資源に依存した国際共同研究において新たな方法論を構築することが可能である．本稿では，既存のシークエンサープラットフォームの特徴を説明したうえで，MinIONを用いて主に薬剤耐性菌を材料として行われている研究例を紹介したい．

シンガポールではデングウイルス感染者が日々発生しているが，それがニュースになることはない．一方，本邦では2015年のデングウイルスの国内感染例が大いに世間を騒がせた．これは日本人にとって熱帯感染症がそれだけ遠い世界の物語である（と思い込んでいる）ことを示していることの証左といえる．しかしながら目を世界に転じれば，そこには熱帯感染症が満ち溢れている．本稿では，近年のポータブルシークエンサーMinIONの熱帯感染症病原性微生物，特にその野外株についてのゲノム解析の応用について概説する．on siteでのシークエンスがより普及すれば，さらに多くの多型あるいは新規の病原性微生物が同定されるかもしれない．

16S rRNA遺伝子のアンプリコンシークエンスによる細菌組成の解析は，ナノポア技術に基づくシークエンサーMinIONの登場により大きく変わりつつある．ロングリードが得られること，そして逐次的なシークエンスが可能という特徴を活かして，われわれを含め世界各地の研究グループがMinIONを使ってさまざまなDNAサンプルの細菌組成を迅速に決定することに成功している．われわれはさらにこの機器のポータブルという特徴を活かし，MinIONとラップトップ型コンピューターを使って持ち運び可能な迅速細菌同定システムを構築した．このシステムは設備の整った研究室ではなくても，医療現場を含む世界各地のさまざまな場面で活躍できる可能性がある．

がん解析において，逆位や転座，大規模な挿入や欠失などの構造変異の検出や同一染色体上の変異パターンを同定（haplotype phasing）することは重要である．しかし，短いリードしか得られない次世代シークエンサーではそれらの解析が困難であった．近年のナノポアシークエンサーを含むロングリード解析技術の発達により，これらの問題は解決されつつある．本稿では，われわれが行ったナノポアシークエンサーでの解析事例を交えつつがんのロングリード解析について概説する．

メンデル遺伝病もしくは単一遺伝子疾患は，ひとつの遺伝子変異が高い浸透率で病気を引き起こす疾患である．単一の分子遺伝学的な原因が明確な表現型へとつながるため，患者家系のシークエンス解析により多くの疾患関連遺伝子が発見されてきた．現在，最も汎用されている方法は大量のショートリードシークエンスによるエクソーム解析であり，原因遺伝子の発見や患者のゲノム診断に成果をあげている．しかし，複雑なゲノム構造異常やリピートのコピー数異常など，この方法では検出困難な変異も存在する．本稿では，特異な原因により発症する骨格筋の遺伝性疾患について，現時点ではナノポアシークエンサーでしか実現できないであろうゲノム診断の可能性について述べる．

大きな技術革新を遂げ続けているシークエンシング分野においてリピート配列は生物種に限らずいまだに対応困難なエレメントの1つであり，その配列を決定するためにはクローニングなどの実験的，あるいはアセンブリ時の計算機的な問題を解決しなければならない．本稿ではクモ糸遺伝子を長鎖リピート配列の例に挙げ，その解決策の1つとしてMinIONに注目し，どのようなアプリケーションが有効的であるかを実際の解析結果とともに紹介する．